米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的測定

1、專業(yè)： 農(nóng)資1202 姓名： 平帆 學(xué)號： 3120100152 日期： 2015.6.19 地點： 農(nóng)生環(huán)B249 裝 訂 線實驗報告課程名稱： 農(nóng)產(chǎn)品檢測與農(nóng)化分析實驗 指導(dǎo)老師： 金崇偉 成績：_實驗名稱： 米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的測定 同組學(xué)生姓名： 余慧珍 一、實驗?zāi)康暮鸵?二、實驗內(nèi)容和原理三、實驗材料與試劑 四、實驗器材與儀器五、操作方法和實驗步驟 六、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理七、實驗結(jié)果與分析 八、討論、心得一、 實驗?zāi)康暮鸵?. 掌握米粉中粗蛋白含量的測定方法半微量消煮蒸餾法；2. 了解凱氏定氮法與其他測定方法的區(qū)別；3. 掌握油料作物粗脂肪的測定方法，熟悉與掌握重

2、量分析的基本操作；4. 了解實驗中粗脂肪測定所采用的方法和優(yōu)缺點。二、 實驗內(nèi)容和原理1. 米粉中粗蛋白測定意義米粉是我國目前消費(fèi)量和消耗大米量最大的大米深加工產(chǎn)品,但目前國內(nèi)米粉生產(chǎn)技術(shù)較低，米粉品質(zhì)尤其是粗蛋白含量隨產(chǎn)品變異較大，因此米粉中粗蛋白的測定對米粉標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化、規(guī)范化生產(chǎn)具有重要意義1。2. 粗蛋白測定硫酸過氧化氫-半微量蒸餾法2.1 待測液制備硫酸-過氧化氫消化法濃硫酸是一種強(qiáng)氧化劑，也是一種脫水劑，在反應(yīng)過程中還起到升溫的作用。過氧化氫是一種氧化劑。米粉在濃H2SO4溶液中，歷經(jīng)脫水炭化、氧化等一系列作用，而氧化劑H2O2在熱濃H2SO4溶液中分解出的新生態(tài)氧具有強(qiáng)烈的氧化

3、作用，分解H2SO4沒有破壞的有機(jī)物和碳。使有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨鹽，該消煮液可用半微量蒸餾法定氮2。反應(yīng)過程：NH2-R-COOH + H2SO4nCO2 +SO2+H2O+NH3；2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4。2.2 粗蛋白含量測定半微量蒸餾法消煮液中的硫酸銨經(jīng)強(qiáng)堿（如30%-40%的氫氧化鈉）堿化使之分解放出暗器，利用蒸汽將氨氣蒸至硼酸溶液中被吸收，氨與硼酸溶液中的氫離子結(jié)合生成銨根離子，使溶液中的氫離子濃度下降。用標(biāo)準(zhǔn)酸液滴定，利用標(biāo)準(zhǔn)酸液消耗體積及其濃度可計算得到標(biāo)準(zhǔn)酸液消耗量，對應(yīng)反應(yīng)方程可計算求出NH4+含量，進(jìn)一步求出米粉粗蛋白含量2。1)蒸餾過程：(NH4)2SO

4、4 + 2NaOH Na2SO4 +2NH3+2H2O2)吸收過程： NH3·H2O + H2BO3NH3·H2BO3+ H2O3)滴定過程：2NH3·H2BO3+ H2SO4 (NH4)2SO4+ 2H2BO3。2.3粗蛋白含量計算公式粗蛋白含量（%）= 其中，V樣品測定所消耗1/2H2SO4的體積（mL）；V0空白試驗所消耗的1/2H2SO4的體積（mL）；c標(biāo)準(zhǔn)的1/2H2SO4濃度(mol/L)；14氮原子的摩爾質(zhì)量（g/mol）；10-3mL換算為L；ts分取倍數(shù)，本實驗為ts=10；m樣品質(zhì)量（g，干基）；K氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，本實驗為K=5.95。

5、3. 粗脂肪測定意義脂肪是糧食、油料中的重要化學(xué)成分。測定糧食、油料中的粗脂肪含量，對評定其可食部品質(zhì)和營養(yǎng)價值具有重要意義。對油料作物如油菜、花生等而言，含油量的高低直接體現(xiàn)了其經(jīng)濟(jì)價值；同時含油量高低又是確定油料等級的重要依據(jù)3。本實驗中提取的脂肪性物質(zhì)為脂肪類物質(zhì)的混合物，其中含有脂肪游離脂肪酸、磷脂酯、固醇、芳香油某些色素及有機(jī)酸等，稱為粗脂肪。4. 油菜粗脂肪含量測定殘余重量法4.1殘余重量法本實驗采用重量法，對提取前的樣品和用脂肪溶劑提起后的脂肪進(jìn)行稱量，通過質(zhì)量差值計算油脂含量，該法適用于固體和液體樣品。通常將樣品浸于脂肪溶劑，為乙醚或沸點30至60的石油醚，借助于索氏提取器（圖

6、1）進(jìn)行循環(huán)抽提2： 4.2粗脂肪含量計算公式粗脂肪含量（%）=（m1+m2-m3）/m2× 100%其中，m1-濾紙的質(zhì)量(g)；m2 -濾紙及烘干樣品的質(zhì)量(g)；m3 -浸提后的濾紙及殘渣的質(zhì)量(g)。三、 實驗器材與儀器1 樣品市售米粉；油菜籽；圖1 索氏提取器2. 試劑乙醚或石油醚、濃H2SO4（密度1.84g/mL）溶液、H2O2溶液、NaOH溶液、甲基紅（含乙醇）-溴甲酚綠混合指示劑、H3BO3指示劑、（1/2 H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)液；3. 器材2.1 粗蛋白測定萬分之一分析天平、消煮爐、消煮管、半微量定氮蒸餾裝置、半微量滴定管（5mL）、錐形瓶、容量瓶、移液管、洗耳球；2

7、.2 粗脂肪測定萬分之一分析天平、高溫鼓風(fēng)烘箱、稱量瓶、藥匙、濾紙、分析天平、毛玻璃板、脫脂棉、索氏提取器。四、 操作方法和實驗步驟1. 米粉中粗蛋白含量測定1.1待測液制備取米粉0.25xxg于100mL消煮管中；加濃硫酸5mL，輕輕搖勻于瓶口處放置一個彎頸漏斗，在消化爐上文火加熱；待濃H2SO4分解冒白煙逐漸升高溫度溶液全部呈棕黑色，取下消煮管，靜置冷卻后滴加H2O2約10d，不斷震搖取出消煮管冷卻，少量水沖洗小漏斗重復(fù)操作至試管溶液呈現(xiàn)清亮色，加熱至微沸10-20min，稍冷后在加熱5-10min，以除盡過剩的H2O2消煮液用蒸餾水定容至100mL，取上清液測定含氮量。同時，消煮時應(yīng)同時

8、做空白試驗以校正試劑。1.2 半微量蒸餾法測定接液錐形瓶中加H3BO3指示劑混合液10mL向蒸餾室內(nèi)緩慢加入10mol/L NaOH溶液20mL，通入蒸汽待餾出液體積約為50mL時，即蒸餾完畢蒸餾前，洗凈蒸餾裝置，先檢查蒸餾裝置氣密性；移液管移取澄清待測液10mL于蒸餾器中用0.0103mol/L（1/2 H2SO4）標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定餾出液由藍(lán)綠色至剛剛變?yōu)樽霞t色，記錄所用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V（mL）和空白測定所用的酸的標(biāo)準(zhǔn)體積V0（mL）用少量以調(diào)節(jié)至pH=4.5的水洗滌冷凝管的末端2. 油菜中粗脂肪含量測定折疊濾紙包（不封口），用鉛筆編號，烘干至恒重（m1）稱取經(jīng)105烘干1h后粉碎試樣m2（約

9、1g）全部移入濾紙包中，封口2.1樣品處理2.2樣品抽提測定在抽提瓶中放入幾粒玻璃或浮石，連接好抽提器，倒入無水石油醚將樣品包有順序地裝入抽提筒中，抽筒內(nèi)最多放40包至出現(xiàn)虹吸作用止，再倒入無水石油醚并保持在超過樣品的高度，使其完全浸泡樣品連接好冷凝管，接通冷凝水，在55水浴鍋上加溫進(jìn)行抽提，連續(xù)抽提6-8h抽提完畢，放出抽提筒中的石油醚，取出樣包，放在通風(fēng)柜內(nèi)晾干；放入105±2°烘箱中干燥3小時，取出放入干燥器冷卻至室溫，稱重，直至恒重（m3）五、 實驗數(shù)據(jù)記錄和處理表1l米粉中粗蛋白含量的測定樣品質(zhì)量m(g)滴定后體積V(ml)滴定前體積V0(ml)稀釋倍數(shù)ts換算系

10、數(shù)K硫酸濃度c(mol/L)米粉中粗蛋白含量（%）實驗組0.25061.9800.02105.950.01034.79注：米粉中粗蛋白計算公式含量（%）= 表2l油菜中粗脂肪含量的測定濾紙質(zhì)量m1(g)濾紙及烘干樣品質(zhì)量m2(g)浸提后濾紙及殘渣質(zhì)量m3(g)油菜籽中粗脂肪含量（%）實驗組0.59561.62331.595838.38注：油菜籽中粗脂肪計算公式含量（%）=（m1+m2-m3）/m2× 100% 六、 實驗結(jié)果與分析1. 米粉中粗蛋白含量的測定本次實驗根據(jù)GB 50095-2010測定得到米粉中粗蛋白含量為4.79%。據(jù)報道1，一般市售米粉的粗蛋白含量范圍為5.47.8

11、%。比較可得，本組測定值較低；而與同一時間測定的其他組比較，其他組測定得粗蛋白含量在4%6%之間。比較可得，本組測定值較為正常?？赡茉蚴遣僮髡`差與米粉品質(zhì)差異，其中影響米粉粗蛋白的影響因素有原大米蛋白質(zhì)含量、加工中糊化程度、浸泡中浸泡液pH和離子強(qiáng)度、制粉中干磨強(qiáng)度等5。而實驗中誤差可能原因與改進(jìn)如下：1.1 誤差實驗中誤差的可能原因有：1)本組在將米粉移如消煮管中，有少許粘附在側(cè)壁上，導(dǎo)致之后的消煮始終無法將在粘附在最上端的米粉溶下，而導(dǎo)致消煮所得待測液中NH4+濃度較低，從而使得粗蛋白測定結(jié)果偏低；2)蒸餾過程中，如NaOH未加過量、蒸餾裝置接頭處有漏氣導(dǎo)致NH3溢出，或蒸餾時間不夠（本

12、次蒸餾終點僅以錐形瓶中溶液達(dá)到50mL為標(biāo)準(zhǔn)），由此導(dǎo)致的NH3未完全被吸收均會導(dǎo)致粗蛋白測定結(jié)果偏低；3）由于是實驗操作考試，本實驗未設(shè)空白對照組，因此在計算結(jié)果時，除加加入米粉之外，消煮前引入的含氮化合物，以及消煮后蒸餾滴定階段引入的NH4+或NH3均會使得實驗結(jié)果測定值偏高，本實驗中該影響程度不可確定；4）本實驗消煮過程開始階段，消煮溫度僅為150，遠(yuǎn)未大濃硫酸微沸的溫度。此時過早加入過氧化氫會使得消煮溫度始終無法達(dá)到理論值；此外，消煮時間過短，反復(fù)取放消煮管造成消煮不充分也會使得消煮不完全。這是本實驗中粗蛋白含量較低的主要誤差來源。5）蒸餾速度過快，或者加熱溫度過高，堿液容易被蒸汽帶出

13、至錐形瓶，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高；且蒸餾結(jié)束拔出入口玻璃塞過快時，會使堿液倒噴入冷凝管，亦導(dǎo)致結(jié)果偏高6。1.2 改進(jìn)針對以上誤差分析，可通過以下方法加以改進(jìn)：1）往消煮管中加入大米時，宜使用長紙條緩慢送入到硬質(zhì)試管底部，盡量減少粉末粘在壁上，影響樣品的消煮。2）消煮過程中應(yīng)留意消煮溫度，調(diào)節(jié)加熱溫度在200250，保證充分的消煮時間。且H2O2滴加第一次不可過早，盡量在等到達(dá)到濃硫酸微沸后一段時間再加入，且滴加時需直接滴入瓶底溶液中，避免滴在瓶壁上，否則H2O2會因高溫快速分解，失去氧化效果。3）蒸餾過程中NH4+在堿性條件下釋放出氨，為防止樣液中氨氣逸出，在檢查好裝置氣密性的前提下1）加入氫氧化

14、鈉溶液需過量；2）縮短待測液的滴加時間，因為操作時間越長，從加入口溢出的NH3越多，使得測定結(jié)果越??；3）水封；4）夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽。4）蒸餾過程中為確定蒸餾是否完畢可在液體即將蒸餾完畢時，打開玻璃塞口，用蒸餾水潤濕的潔凈紅色石蕊試紙檢驗蒸汽中是否存在NH3。此過程操作亦需快速完成。若試紙變紅，則說明蒸餾未結(jié)束，反之，則可終止蒸餾過程。5）定容和滴定時，需等溶液充分冷卻至室溫后方可進(jìn)行，否則由于溫度的變化會影響定容的準(zhǔn)確性和滴定終點的判斷。6）所用的試劑溶液必須用無氨蒸餾水配制，且在轉(zhuǎn)移待測液時盡量避免氨氮的污染。2. 食品中粗脂肪含量的測定本次實驗根據(jù)GB 5490-1985測定得到

15、油菜籽中脂肪含量為38.38%，油菜籽中油脂的含量為37.5%46.3%，且根據(jù)油菜的類型不同其油脂含量略有不同8。對比可得，本實驗測定值在正常范圍之內(nèi)，且與同一時間其他組測定值較為接近。由于本實驗中，索氏提取器部分有助教代為操作完成，因此以下分析可能的誤差原因，實際狀況尚未可知。2.1 誤差實驗中誤差原因可能有以下幾點：1)烘干樣品吸水。經(jīng)過索氏提取器對油脂進(jìn)行提取后的紙包要進(jìn)行烘干，但因烘干與稱量時間相隔較久，且當(dāng)天環(huán)境中相對濕度較大，濾紙與油菜籽等吸水導(dǎo)致測定結(jié)果偏低；2)提取不完全。多個樣品共同提取時，部分脂肪物質(zhì)沒有提取完全，因而導(dǎo)致實驗結(jié)果偏低：3） 烘干冷卻時間不一致。且時間過長

16、時，不飽和脂肪酸會因受熱氧化而增加質(zhì)量，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高9。2.2 改進(jìn)1）稱量油菜籽樣品之后，迅速包好濾紙，加入索氏提取器；或縮短烘干與稱量的時間，減少其吸水帶來的誤差；2）增加單個濾紙包內(nèi)油菜籽質(zhì)量，同時單個索氏提取器內(nèi)加入樣品數(shù)量，且濾紙包需在保證油菜籽不外漏的前提下，使得乙醚提取液能與其充分接觸，提高脂肪提取率；3）保證烘干冷卻時間一致，且烘干時間不宜過長。七、 討論、心得問題1 粗蛋白含量測定方法之間的比較？ 目前，粗蛋白的方法主要以傳統(tǒng)蒸餾滴定法和儀器自動檢測法為主。下面將就強(qiáng)堿直接蒸餾法、雙氧水法（本實驗采用）、凱氏定氮儀法進(jìn)行比較。先簡要介紹強(qiáng)堿直接蒸餾法和凱氏定氮儀法原理與操

17、作步驟。1.1 強(qiáng)堿直接蒸餾法10強(qiáng)堿直接蒸餾法是間接測定粗蛋白質(zhì)的一種簡便的方法。其將樣品在強(qiáng)堿中消煮，使飼料中的-氨基、酰氨基以及某些特殊基團(tuán)上的氮素在強(qiáng)堿的作用下以氨的形式釋放出來，直接蒸餾到硼酸中，再用鹽酸溶液來滴定，根據(jù)鹽酸消耗量來計算出DD法所測得的表觀含氮量。計算公式與雙氧水法類似。1.2 凱氏定氮儀法11BuchiK-370 全自動凱氏定氮儀，其將樣品在催化劑與硫酸加入后，置于紅外線消化爐上消煮，后用全自動凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾滴定。即放入已消化好的樣品，用pH6.86和4.00兩種標(biāo)準(zhǔn)液校正后，即可自動蒸餾、滴定。并可根據(jù)儀器給出的標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量進(jìn)行計算。1.3 三種方法比較強(qiáng)堿直

18、接蒸餾法與雙氧水法比較，偏差比自動定氮儀打但均在國際法兩個平行樣品測定允許誤差范圍之內(nèi)。強(qiáng)堿直接蒸餾法分析速度快，消煮與蒸餾同步進(jìn)行，節(jié)省時間，但缺點是蒸餾時對操作控制較為嚴(yán)格，稍有不慎蒸餾物亦產(chǎn)生泡沫狀，不易與氨氣的揮發(fā)。雙氧水法與凱氏定氮儀法比較如下表111，對比看出BuchiK-370全自動凱氏定氮儀與半微量蒸餾法測定 8組不同濃度飼料中的粗蛋白含量的最大相對偏差為0.51%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)差為0.16%。比較兩種方法，1）全自動定氮儀紅外輻射加熱只需要90120min，大大縮短消化時間，節(jié)省電能；而半微量蒸餾法消煮時間通常在35h；2）全自動定氮儀減少人為操作誤差，通過電極判斷的滴定終點

19、優(yōu)于人肉眼判斷變色；3）全自動定氮儀減少轉(zhuǎn)移冷卻定容等步驟，避免環(huán)境中氨對樣品污染導(dǎo)致的誤差，而半微量蒸餾法并不能消除這種誤差11。但針對不同粗蛋白含量的樣品，需采用不同的稱樣量（如表1右），且若裝置氣密性不加，會到使得樣品吸出導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確，且該儀器成本較大，不適合研究實驗操作。綜上，與半微量蒸餾法相比，強(qiáng)堿直接蒸餾法用強(qiáng)堿消煮與蒸餾效果略遜，但準(zhǔn)確度尚可，適用實際生產(chǎn)檢測所用；而凱氏定氮儀法（自動）雖然省時節(jié)能，操作更為精確，但成本高，且不適于鍛煉實驗操作技能。綜合考慮后，半微量蒸餾法是用于科研教學(xué)實驗的最佳方法。問題2 油料脂肪測定方法之間的比較？目前，國內(nèi)外測定粗脂肪的方法有十余種

20、之多，而抽提法是常用的脂肪測定方法。其中，索氏抽提法(Soxhlet extractor method)為脂肪含量測定的經(jīng)典方法。下面就索氏抽提浸泡法及阿貝折射儀法與索氏抽提法（本實驗采用）作比較。索氏抽提法根據(jù) GB 5490-1985，索氏抽提浸泡法及阿貝折射儀法的操作步驟如下3。2.1索氏抽提浸泡法用烘盒稱取2 g5 g 樣品，于105 左右烘箱中烘30 min，趁熱倒入研缽中研細(xì)，用濾紙包扎好樣品，放入抽提筒內(nèi), 加入乙醚，虹吸一次, 再加入乙醚使濾紙包浸泡在乙醚中，浸泡8 h12 h(過夜)，然后抽提至抽提筒內(nèi)的乙醚用玻片做點滴實驗無油跡為止(約1 h2 h)。抽凈脂肪后,

21、 取出濾紙包，加熱回收溶劑。將抽提瓶中的乙醚揮干，置于105 烘箱，烘90 min 后再烘30 min 至恒重，抽提瓶增重的質(zhì)量即為脂肪的質(zhì)量。脂肪含量計算類似于本實驗中計算公式。2.2阿貝折射儀法稱取研細(xì)后的均勻樣品5.00 g10.00 g，置于小燒杯中，加入10 g15 g 無水Na2SO4，用玻棒攪拌，以吸干水分。精確加入有機(jī)溶劑(-溴代萘)5 ml10 ml，用研棒充分研磨使脂肪溶出，靜置數(shù)分鐘后，將漿狀物轉(zhuǎn)入有濾紙的漏斗中過濾，取濾液12 滴，用阿貝折射儀測定混合液的折射率。式中，V加入溶劑量(ml)；20 時脂肪的密度(一般取0.92 g/ml，亦可根據(jù)所用油脂的種類查得或?qū)崪y，

22、 因溫差1 時校正值為0.00064 ，故可不校正)；m 樣品的質(zhì)量(g)；n 純?nèi)軇┑恼凵渎?-溴代萘為1.6582 , 八角茴香油為1.5503 , 二碘乙烯為1.742 , 亦可根據(jù)實際所用溶劑測定)；n1 混合液的折射率；n2 油脂的折射率。2.3三種方法比較表中3對比可以看出，后兩方法與GB 5497-1985所得結(jié)果，絕對偏差平均值為0.04%，相對偏差平均值為0.018%，均為達(dá)到顯著性差異水平，這說明兩種發(fā)發(fā)測定結(jié)果較為準(zhǔn)確。其中，索氏抽提浸泡法測定結(jié)果與國標(biāo)法相比有負(fù)偏差，這主要是在浸泡過程中沒有對流充分，使得脂肪大部分只能溶解在乙醚，從而影響下一步測定。但國標(biāo)法對抽提瓶要求高，在測定前需達(dá)到恒重，操作中亦需防治污染且在烘干脂肪時常常因脂肪氧化后質(zhì)量增加而使得恒重難以實現(xiàn)，且工作效率較低，而索氏抽提浸泡法只需12h即可完成，這在實驗教學(xué)和實際生產(chǎn)檢測中較為實用。而阿貝折射儀法測定的相對偏差平均值為0.002 %。阿貝折射儀法克服了國標(biāo)等其他索氏抽提法耗時長的缺點，具有方便、快速等優(yōu)點，是糧食、油料收購部門可選用的方法。此方法主要是依據(jù)脂肪溶于有機(jī)溶劑的特性，選擇某種比脂肪有較高折射率的有機(jī)溶劑，通過研磨使樣品中的脂肪溶解出來。之所以阿貝折射儀法相對偏差較大時由于研磨中細(xì)度、時間、溫度對會影響測定準(zhǔn)確度，