護(hù)骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果

1、護(hù)骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果         【摘要】  目的評(píng)估藏藥護(hù)骨十五丸抗老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果。方法50只雌性22月齡老年大鼠，分為藏藥護(hù)骨十五丸大、中、小劑量治療組，雌激素治療組及老年模型組，連續(xù)給藥50 d；另6月齡大鼠12只作為青年對(duì)照組。觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠骨形態(tài)、骨密度、骨生物力學(xué)的改變。結(jié)果22月齡雌性大鼠可作為骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停蛔o(hù)骨十五丸大劑量治療組可顯著增加骨松質(zhì)面積、骨皮質(zhì)指數(shù)（30，15,P0.05），可顯著增加股骨骨密度、股骨的最大變形能力，減少骨鈣丟失。結(jié)論藏

2、藥護(hù)骨十五丸對(duì)老齡雌性大鼠骨質(zhì)疏松有顯著改善或阻止骨質(zhì)疏松發(fā)展的作用，提示該制劑對(duì)女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥具有預(yù)防和治療作用。 【關(guān)鍵詞】  骨質(zhì)疏松；老年；雌性大鼠；護(hù)骨十五丸骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是骨骼骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)喪失所致的一種骨代謝性疾病，以骨顯微結(jié)構(gòu)改變、單位骨體積骨量減少和骨生物力學(xué)改變?yōu)樘卣?。世界上骨質(zhì)疏松患者約達(dá)2億人，骨質(zhì)疏松癥成為危害老年人健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前骨質(zhì)疏松癥的臨床治療多以西藥為主，如雌激素、降鈣素、鈣劑、維生素D、二磷酸類(lèi)及氟化物等2，醫(yī)學(xué)上雖開(kāi)發(fā)了較多抗骨質(zhì)疏松藥物，但仍未成為主導(dǎo)療法3。祖國(guó)醫(yī)學(xué)是一個(gè)豐富的寶藏,對(duì)

3、骨質(zhì)疏松有豐富的論述，認(rèn)為腎虛是腰腿痛的根本原因，藏藥護(hù)骨十五丸系杜仲、續(xù)斷、乳香、沒(méi)藥、雪蓮花、西紅花等組成，有補(bǔ)腎壯腰、溫經(jīng)活血之功效。本實(shí)驗(yàn)主要觀察藏藥護(hù)骨十五丸治療老年雌性大鼠骨質(zhì)疏松的效果，以期找到一種預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的有效藥物。1 材料1 藥物藏藥護(hù)骨十五丸系杜仲、續(xù)斷、乳香、沒(méi)藥、雪蓮花、西紅花等組成,本研究按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求,取膠丸制備成供試藥物(自制)。2 動(dòng)物健康純種SD大鼠62只，雌性，其中22月齡50只，體重（330±14）g，6月齡大鼠12只，由西安交通大學(xué)動(dòng)物中心提供（國(guó)家A級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）。全部大鼠飼養(yǎng)條件一致，自由攝食，喂以大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料（由西安交通大學(xué)動(dòng)物中

4、心提供），飲用蒸餾水。2 方法2.1 老齡大鼠骨質(zhì)疏松模型的選定為能更確切模擬人類(lèi)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)采用老齡未曾生育大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。50只老齡未經(jīng)生育大鼠自然飼用常規(guī)飼料和蒸餾水22個(gè)月，作為老齡大鼠骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.2 治療分組及治療時(shí)間采用老齡大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，隨機(jī)分為5組：大劑量治療組（A組，劑量：3.5 g/kg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%）10只；中劑量治療組（B組，劑量：1.5 g/kg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%）11只；小劑量治療組（C組，劑量0.5 g/kg，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）9只；無(wú)措施22月老年模型組D組，0.6 g/kg,6.0%(g/g)乳劑9只；己烯雌酚組E組，0.0

5、4 mg/kg,0.4%（mg/g）乳劑11只；另6月齡大鼠12只作為青年對(duì)照組F組，0.6 g/kg，6%（g/g）乳劑。其供試液溶劑大、中、小劑量組，老年模型組，己烯雌酚組，青年對(duì)照組均用伯洛沙姆制成6.0%(g/g)乳劑，治療期為50 d。2.3 取材實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在20%烏拉坦溶液麻醉（0.5 ml·100 g-1）下, 腹腔動(dòng)脈抽血處死，取動(dòng)物雙側(cè)后肢股骨、脛骨，分別固定于4 % 多聚甲醛中或放置于低溫冰箱固定和保存。備測(cè)骨鈣的股骨以紗布包裹后放置于低溫冰箱固定和保存。2.4 觀察指標(biāo)與方法取股骨中部橫斷面HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下測(cè)量計(jì)算骨皮質(zhì)厚度指數(shù)。計(jì)算方法 &#

6、160; 骨皮質(zhì)厚度指數(shù)AB+CD/AD   其中AB，CD，AD見(jiàn)圖1（48個(gè)部位處測(cè)量后求均值） 。取適量股骨精密稱重,置消化罐中,加混合酸(HNO3HClO4=41)3 ml,密閉后置烤箱中105消化2 h,消化液取不同稀釋度分析各元素含量。 鈣(Ca)采用Z-8000型塞曼偏振原子吸收分光光度計(jì)分析。鈣元素分析過(guò)程中的質(zhì)量控制用USEPA和粉質(zhì)發(fā)樣進(jìn)行質(zhì)控，采取混合血樣控制。樣品處理過(guò)程中嘗試了灰化法、試管內(nèi)混合酸消化法,最終選擇了密閉消化罐消化,并做了回收實(shí)驗(yàn),回收率97.4%104.2%。用QDR-2000型HOLOJAC雙光子骨密度儀測(cè)量股骨骨礦密度, 放射源

7、為镅241Am,誤差 3 %。測(cè)量時(shí)，將各離體骨按一定順序放入有機(jī)玻璃盒內(nèi)，注入蒸餾水（以剛好蓋過(guò)所有骨面為宜）進(jìn)行掃描。使用Regional high resolution QDR 4500 小動(dòng)物分析軟件。右股骨用微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)力學(xué)試驗(yàn)，觀察最大應(yīng)力。當(dāng)外力作用于骨時(shí)，骨以形變產(chǎn)生內(nèi)部的阻抗即骨產(chǎn)生的應(yīng)力來(lái)抗衡外力用最大負(fù)荷力表示，單位為g/cm 2。應(yīng)變是指骨在外力作用下的變形，大小等于骨受力后長(zhǎng)度的變化量，用最大負(fù)荷表示，單位為厘米。測(cè)量時(shí)，調(diào)整兩個(gè)約束支架相距20 mm ,將兩個(gè)大鼠股骨比較均勻的部位放在兩個(gè)約束支架上，股骨的短軸與垂直方向平行，逐級(jí)加壓直至破壞，讀取

8、導(dǎo)致破壞的負(fù)荷的數(shù)據(jù)。待測(cè)試件用生理鹽水保持濕潤(rùn)，荷載測(cè)量精度為0.1 N，變形測(cè)量精度為0.001 mm。2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，用SPSS 10.0 for windows軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)算結(jié)果以±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)0.05，P0.05。         3 結(jié)果3.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型骨形態(tài)學(xué)變化股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨切片顯示，青年對(duì)照組骨小梁密度高而完整，排列規(guī)則；老年模型組骨小梁明顯稀疏，排列不整，骨小梁間隙增大，骨小梁面積比增大，老年模型組骨小梁密度、骨小梁面積顯著低于青年對(duì)照

9、組(見(jiàn)表1)，證實(shí)骨質(zhì)疏松大鼠模型成立。表1  實(shí)驗(yàn)大鼠各組骨形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果比較（略）3.2 藏藥護(hù)骨十五丸對(duì)骨形態(tài)學(xué)的影響表1示護(hù)骨十五丸大、中劑量治療組骨小梁密度顯著高于老年模型組（P0.05），達(dá)到雌激素治療對(duì)照組水平（P0.05），但上述各組均顯著低于青年對(duì)照組水平（P0.05）。大劑量治療組骨皮質(zhì)指數(shù)比顯著高于老年模型組（P0.05），且達(dá)到青年對(duì)照組水平（P0.05）。護(hù)骨十五大劑量組增加骨小梁面積較增加骨皮質(zhì)指數(shù)比明顯（3015,P0.05）。3.3 各實(shí)驗(yàn)組骨鈣含量比較各實(shí)驗(yàn)組骨鈣含量結(jié)果表明（見(jiàn)表2），護(hù)骨十五丸大、中、小劑量治療組大鼠股骨鈣含量與雌激素治療對(duì)照組之

10、間無(wú)顯著性差異，但顯著高于老年模型組，低于青年對(duì)照組（P0.05）。表2  實(shí)驗(yàn)各組大鼠骨鈣含量和骨密度比較（略）3.4 股骨及椎體骨密度股骨骨密度測(cè)試結(jié)果表明（見(jiàn)表2），護(hù)骨十五丸大劑量組顯著高于老年模型組，但仍顯著低于青年對(duì)照組（P0.05）；同時(shí)中、小劑量組與雌激素組、老年模型組之間無(wú)顯著性差異（P0.05）。椎骨骨密度測(cè)試結(jié)果表明，大、中、小劑量組與雌激素組、老年模型組之間無(wú)顯著性差異（P0.05），均顯著低于青年對(duì)照組（P0.05）。3.5 股骨生物力學(xué)骨生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明（見(jiàn)表3），護(hù)骨十五丸大、中、小劑量治療組與雌激素組骨最大負(fù)荷力無(wú)顯著性差異，均低于青年對(duì)照組（P0

11、.05）。護(hù)骨十五丸大、中、小劑量治療組與雌激素組之間骨最大變形無(wú)顯著性差異，但高于老年模型組，低于青年對(duì)照組（P0.05）。表3  實(shí)驗(yàn)各組大鼠骨生物力學(xué)結(jié)果比較（略）4 討論   本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藏藥護(hù)骨十五丸可提高或改善骨質(zhì)疏松癥的骨顯微結(jié)構(gòu)、骨密度及股骨的最大變形，減少骨鈣丟失。   既往研究藥物治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果，均采用切除卵巢形成的去勢(shì)雌性大鼠作為模型4，但此種模型雖可較好的模仿人類(lèi)婦女正常絕經(jīng)的骨丟失狀態(tài)，但去勢(shì)雌性大鼠股骨縱徑及股骨中軸的骨生物力學(xué)及骨密度不發(fā)生顯著性改變5，因此不符合人類(lèi)自然衰老的狀態(tài)。伴隨著絕經(jīng)時(shí)間的增

12、加，老年婦女的骨質(zhì)疏松既受絕經(jīng)因素的影響又受年齡因素的影響6。采用未經(jīng)生育的老年雌性大鼠作為骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可更好的模擬人類(lèi)老年婦女的骨質(zhì)疏松癥的狀態(tài)，為研究藥物防治絕經(jīng)晚期婦女骨質(zhì)疏松癥提供較好的基礎(chǔ)。   在實(shí)驗(yàn)中,為了客觀地評(píng)價(jià)藥物的效應(yīng),設(shè)立了3個(gè)對(duì)照組,分別為老年模型組、青年對(duì)照組、雌激素組(陽(yáng)性藥物組)，藏藥護(hù)骨十五丸分為3個(gè)劑量組,來(lái)評(píng)價(jià)藥物的劑量效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,青年對(duì)照組和老年對(duì)照組有明顯差異,證實(shí)了模型的成功選擇。   藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藏藥護(hù)骨十五丸可以治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松癥，這與藏藥護(hù)骨十五丸的補(bǔ)腎壯腰、溫經(jīng)活

13、血之功效是相符的。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)骨痿、骨痹的范疇，醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥之病機(jī)主要表現(xiàn)為脾腎虧、損氣滯血瘀和風(fēng)寒濕阻,其中脾腎虧盤(pán)損是內(nèi)因,氣滯血瘀與風(fēng)寒濕阻則為外因所致7。絕經(jīng)后婦女不僅腎衰髓減,而且脾氣亦衰，脾腎虛則氣血運(yùn)行遲緩,脈絡(luò)不暢可致血瘀若遇外傷或感受風(fēng)寒濕邪,即易出現(xiàn)腰腿酸痛等一系列癥狀8,9。立方之關(guān)鍵在于標(biāo)本兼顧、攻補(bǔ)兼施,既要考慮脾腎不足而補(bǔ)之,又要顧及風(fēng)寒濕邪與外傷后導(dǎo)致氣滯血淤而攻之。杜仲、續(xù)斷補(bǔ)腎壯腰；乳香、沒(méi)藥活血散瘀、行氣舒筋；雪蓮花、西紅花祛風(fēng)寒濕邪，全方共奏補(bǔ)腎壯腰、溫經(jīng)活血之功效。   抗骨質(zhì)疏松的治療多通過(guò)提高骨密度，但抗骨質(zhì)疏松

14、的最終目標(biāo)是提高骨生物力學(xué)、減少骨折發(fā)生率，尤其是股骨頸、椎體的骨折率10 。用大、中、小3組劑量的藏藥護(hù)骨十五丸治療自然衰老的雌性骨質(zhì)疏松癥大鼠的結(jié)果表明，大劑量組可明顯改善股骨骨質(zhì)疏松的顯微結(jié)構(gòu)、骨密度及股骨的最大變形，減少骨鈣丟失，表明藏藥護(hù)骨十五丸可以通過(guò)改善骨的皮質(zhì)厚度、骨松質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)及增加骨密度多途徑而提高骨的生物力學(xué)性能，因此可以治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松。   本實(shí)驗(yàn)中雖然低、中劑量藏藥護(hù)骨十五丸對(duì)骨質(zhì)疏松的效果沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，但仍能看出其對(duì)骨質(zhì)疏松具有劑量-效果效應(yīng)的趨勢(shì)，隨著給藥劑量的增加，改善骨質(zhì)疏松的效果越明顯，但其最佳有效劑

15、量尚待進(jìn)一步研究。   本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藏藥護(hù)骨十五丸可以通過(guò)改善骨的皮質(zhì)厚度、骨松質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)及增加骨密度多途徑而提高骨的生物力學(xué)性能，提示藏藥護(hù)骨十五丸可治療和預(yù)防老年女性絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松。【參考文獻(xiàn)】  1Pablo J. Enriori, Carlos L. Enriori . The pathogenesis of osteoporosis in older women and menJ. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology,2002,8: 1.2郭世紱. 骨質(zhì)疏松癥的藥物治療及

16、其理論基礎(chǔ)J. 中華骨科雜志，2004,24(11）: 691.3李平生. 骨質(zhì)疏松癥治療用藥最新進(jìn)展J. 中國(guó)處方藥，2005,1:39.4Matthew J. Silva, Michael D. Brodt, Brian A. Morphological and mechanical properties of caudal vertebrae in the SAMP6 mouse model of senile osteoporosisJ. Bone, 2004, 35:425.5Ken Watanabe, Akinori Hishiya. Mouse models of senile osteoporosisJ. Molecular Aspects of Medicine, 2005,26: 221.6唐志榮, 尹東，黃東,等. 老年性骨質(zhì)疏松患者股骨近端骨質(zhì)量的改變.中國(guó)臨床康復(fù)，2005,3(9): 200.7王玲,哈孝賢,于順祿. 骨丹對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥防治作用的實(shí)驗(yàn)研究J.天津中醫(yī)藥，2004,21(5):398.8林燕萍,周瑞祥,郭世明,等.健骨顆粒對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨質(zhì)量的影響J.中國(guó)中