扁穗牛鞭草種質遺傳多樣性的ISSR分析

1、扁穗牛鞭草種質遺傳多樣性的ISSR分析范彥1,2，李芳1，張新全1* ，馬嘯1（1. 重慶市畜牧科學研究院 重慶 400039；2 四川農業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 雅安 625014.）摘要：用ISSR標記對來自中國西南地區(qū)(四川、重慶、貴州)的28份扁穗牛鞭草材料的遺傳多樣性進行了檢測。從96個ISSR引物中共篩選出13個多態(tài)性明顯、反應穩(wěn)定的引物，對28份材料DNA共擴增出129條譜帶，平均每個引物擴增出9.9條帶，多態(tài)性條帶比率達84.2%。材料間遺傳相似系數(shù)在0.4660.98之間，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。通過聚類分析和主成分分析，將28份扁穗牛鞭草分為兩大類，同一地區(qū)的扁穗牛鞭草品種(

2、系)基本聚在同一類，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律?；痦椖浚褐貞c市自然科學基金（CSTC,2006BA1022）；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”(NCET-04-0909)。作者簡介：范彥（1973-），男，四川樂山人，四川農業(yè)大學在讀博士，研究方向：牧草與草坪草種質資源及育種。E-mail:cq_fy001；Tel：02346792513關鍵詞：扁穗牛鞭草；種質；ISSR；遺傳多樣性分析Genetic Diversity of Hemarthria compressa Germplasm Detected by Inter-simple Sequence Repeat (ISSR)FAN Y

3、an1,2, LI Fang1，ZHANG Xin-Quan1*, MA Xiao1（1. Department of Grassland Science, Sichuan Agricultural University, Sichuan Yaan 625014，China）（2. Chongqing Municipal Institute of Animal Husbandry Chongqing 400039, China）Abstract: Inter-simple sequence repeat (ISSR) method was applied to detect genetic v

4、ariation of 28 Hemarthria compressa accessions from Southwest China (Sichuan Province, Chongqing City and Guizhou Province). Thirteen primers were selected from 96 ISSR primers, and 129 DNA fragments were amplified from 28 samples. Of which, 110 fragments were polymorphic (percentage of polymorphic

5、bands was 84.2%), and the average number of DNA bands was 9.9 per primer. The genetic similarity among all accessions ranged from 0.466 to 0.98, which indicated that the genetic diversity was comparatively rich among the tested accessions. UPGMA cluster based on genetic similarity and principle comp

6、onent analyses (PCoA) based on band patterns divided the accessions into two groups corresponding to their geographical sources. Key words: Hemarthria compressa; Germplasm；ISSR; Genetic diversity analysis牛鞭草屬(Hemarthria R.Br.)植物主要分布在熱帶、亞熱帶及北半球的溫帶濕潤地區(qū)，我國有4個種和1個變種，即:扁穗牛鞭草H.compressa(L.F.)R.Br.、牛鞭草H. A

7、ltissima (Poir) Stapfet C. E. Hubb.、長花牛鞭草H. Longiflora (Hook.f.) A.Canus、小牛鞭草(H.protensa Steud.)及變種族穗牛鞭草H.compress var.fasciculate(Lam.)Keng，其中分布最廣的是扁穗牛鞭草1。扁穗牛鞭草為多年生匍匐性禾草，主要靠地上莖繁殖，是一種生長期長、生長速度快、再生力強和產量高的常年青綠優(yōu)良飼草2。在長江流域，野生扁穗牛鞭草分布相當廣泛，且存在多種生態(tài)類型。因其綠期長、固土力強且耐粗放管理，具有較強的適應性和抗逆性，也可作為水土保持植物和草坪草開發(fā)利用，對長江流域退耕還

8、草、種草養(yǎng)畜、水土保持及環(huán)境綠化等均具有重要意義，是熱帶、亞熱帶建植人工草地、南方草山草坡改良的優(yōu)良草種3。目前國內外有關牛鞭草屬植物的研究主要集中在細胞學、抗逆性和適應性、侵占性、獨居和化感作用等方面，而在種質遺傳多樣性方面的研究報道較少48。1994年由Zietkiewicz9等創(chuàng)建的ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標記技術克服了RAPD標記穩(wěn)定性差、RFLP技術費用高、AFLP技術操作繁瑣和SSR技術預先根據(jù)其靶序列設計引物等缺點，其重復性和穩(wěn)定性好10，已被廣泛用于品種鑒定11、種質遺傳多樣性分析1214、指紋圖譜構建15等研究中。本試驗運用IS

9、SR標記對我國西南區(qū)28份扁穗牛鞭草資源的遺傳多樣性進行了研究，旨在明確ISSR標記在扁穗牛鞭草品種鑒定和種質遺傳多樣性研究中的作用，為我國扁穗牛鞭草種質的合理利用及新品種選育提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試材料 材料為西南區(qū)收集的的28份優(yōu)良扁穗牛鞭草無性系 (表1)。其中，“重高”和“廣益”是四川農業(yè)大學杜逸等1987年利用無性系重復選育，從野生扁穗牛鞭草中選育的直立型扁穗牛鞭草品種16。表1 扁穗牛鞭草材料編號及來源Table 1 Sampled locations and habitant of Hemarthria compressa編號NO.名稱name采集地點Collec

10、tion Location海拔Altitude(m)編號NO.名稱name采集地點Collection Location海拔Altitude(m)1YA2002-2四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan province41615H029四川寧南Nin Nan County Sichuan province6502YA2002-4四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan province41616H031重慶李子壩Li Zi Ba Chong Qing Province2603YA2002-5四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan provi

11、nce41617H033重慶萬州WanZhou County Chong Qing Province4904YA2003-1四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan province41618H035重慶梁平Liang Pin County Chong Qing Province4005YA2003-2四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan province41619H040重慶墊江DianJiang County Chong Qing Province4106YA2003-3四川洪雅陽坪Hong Ya County Sichuan province41620

12、H042貴州獨山Du Shan County Gui Zhou Province9307YA2003-4四川雅安Ya An County Sichuan province41621H043貴州獨山Du Shan County Gui Zhou Province9508YA2003-5四川雅安Ya An County Sichuan province41622H047貴州荔波Li Bo County Gui Zhou Province3709YA2003-6四川雅安Ya An County Sichuan province41623H053四川寧南Nin Nan County Sichuan p

13、rovince110010H001四川大渡河Da Du River Sichuan province50024H054四川自貢Zi Gong County Sichuan province64011H002四川雅安Ya An County Sichuan province41625H055四川自貢Zi Gong County Sichuan province62012H016四川眉山Mei Shan County Sichuan province46526H065四川雅安Ya An County Sichuan province41613H019四川草壩Cao Ba County Sichua

14、n province48027廣益Guang Yi四川雅安Ya An County Sichuan province41614H026四川寧南Nin Nan County Sichuan province120028重高Chong Gao重慶Chong Qing Province600注：編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9的材料為“廣益” 扁穗牛鞭草品種的選系Note: Codes 1-6 and codes 7-9 are the excellent clone strains from cultivar Guangyi.1.2 DNA提取 取生長良好的扁穗牛鞭草幼嫩植株的葉片，參照S

15、aghai-Maroof M A等(1998)的CTAB17方法提取DNA。1.3 ISSR反應體系的建立及優(yōu)化本試驗參考了地毯草（Axonopus compressus (Sw.) Beauv）18、鴨茅（Dactylis glomerata）19的ISSR擴增程序和反應體系，PCR反應程序為：94預變性5min；94變性45s，52退火60s，72延伸90s,45個循環(huán)；72延伸7min，4保存。并對反應體系各組份進行了梯度PCR試驗，所得20L優(yōu)化反應體系為：Mg2+ 1.625mM、dNTP 250M、Taq酶1.0U、引物濃度 0.75m、模板DNA量 4ng/L。1.4 ISSR引

16、物的篩選采用加拿大British Columbia大學公布的96個常用ISSR引物序列，由大連寶生物公司合成。每個引物取少量稀釋成10pmol/L，用YA2003-3、H001、H043、H055 4份材料的DNA作為模板，在96個引物中篩選出多態(tài)性高的引物，再對全部材料進行PCR擴增。1.5 PCR擴增及電泳PCR擴增在Thermo Hybaid PCR儀上進行。PCR反應結束后向擴增產物中加入6L的6×loading buffer，用1.6%的瓊脂糖凝膠電泳（5V/cm），凝膠中含0.01%溴化乙錠，電泳5h后用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)對凝膠板檢測并照相并分析。1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

17、對獲得的DNA條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，依此構成原始數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSY-PC2.10軟件計算Dice遺傳相似系數(shù)，根據(jù)UPGMA法 (Unweighted pair group method arithmetic averages) 20進行聚類分析和主成分分析（PCoA）。2 結果與分析2.1 篩選引物從96條引物中共篩選出13條多態(tài)性好、條帶清晰的引物(表2)，用于供試28個材料的PCR擴增。在13個引物中，有8個二核苷酸重復序列，1個四核苷酸重復序列，2個五核苷酸重復序列，1個5錨定的重復序列，1個混合基元。表2 用于扁穗牛鞭草ISSR分析的引物序列Tab

18、le 2 Primer sequences used in ISSR analyses of Hemarthria compressa引物代號引物序列(5-3)引物代號引物序列(5-3)Primer codePrimer sequencePrimer codePrimer sequence811(GA)8C860(TG)8RA817(CA)8A873(GACA)4821(GT)8T880(GGAGA)3853(TC)8RT881(GGGGT)3855(AC)8YT886VDV(TC)856(AC)8YA895AGA GTT GGT ACG TCT TGA TC857(AC)8YG：D = (A

19、,G,T)，V = (A,C,G)，R = (A,G)，Y = (C,T)2.2 ISSR擴增結果及多態(tài)性分析13個引物共擴增出129條帶，片段大小在300bp2000bp之間;平均每個引物的擴增條帶數(shù)為9.9條，最多能得到14條清晰帶(857、895),最少有7條(860、881、886);多態(tài)性條帶總數(shù)為110條，平均每個引物能擴增出8.5條，引物的平均多態(tài)性比率為84.2%(表3)。其中，多態(tài)性最高的為混合基元895號和二核苷酸重復序列857號，可分別擴增出14條和13條多態(tài)帶，多態(tài)性比率分別達100%和92.9%。這表明，如果對扁穗牛鞭草進一步做ISSR研究，其引物最好選混合基元和二核

20、苷酸重復序列類型的引物。2.3ISSR鑒定標記在所用的ISSR引物中，以引物857區(qū)分28個材料的效果較為明顯，即使是親緣關系很近的材料，也可根據(jù)其指紋將其分開(圖1)?！皬V益”的9個選系與“廣益”相比都存在一定的ISSR變異；其次，在“廣益”的9個選系中，來自四川雅安的3個材料和來自四川洪雅陽坪的6個材料間在約1100bp、600bp、440bp處有分別有一條多態(tài)性帶，在來自四川洪雅陽坪的6個材料中，YA2003-2在700bp處有一條特有帶(箭頭所示)，與其它5個材料間均存在一定差異，這說明ISSR標記在扁穗牛鞭草指紋圖譜建立和品種鑒定中具有較好的效果。表3 扁穗牛鞭草ISSR標記的多態(tài)性

21、分析Table 3 Polymorphism analysis for banding patterns amplified of H. compressa by different ISSR primers引物primer擴增總條帶Total numbers of polymorphism bands多態(tài)性條帶數(shù)Numbers of polymorphism bands多態(tài)性比率The percent of polymorphism bands811121083.3%81711981.8%8219777.8%85310880%8558787.5%8569888.9%857141392.9%8

22、607571.4%8739777.8%880121083.3%8817685.7%8867685.7%8951414100%合計(Sum)129110平均 (Mean)9.98.584.2%2000bp1000bp750bp500bp250bp圖1 857號引物對28份材料DNA的ISSR擴增圖譜Fig.1 ISSR fingerprint amplified with primer No.857 in 28 DNA of Hemarthria compressa2.528份扁穗牛鞭草材料聚類分析利用NTSYS軟件計算出的28份扁穗牛鞭草材料間遺傳相似系數(shù)(GS)值變動于0.4660.98之間

23、，平均GS值為0.722。其中來自四川寧南的H029和貴州獨山的H042之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.466，表明它們之間的親緣關系最遠；來自四川陽坪的YA2002-4和YA2002-5之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.98，說明其親緣關系最近。第類第類圖2 28個扁穗牛鞭草材料的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for 28 Hemarthria compress accessions based on DICE coefficient進一步采用UPGMA法對供試28份材料進行聚類分析，其結果如圖2所示。在GS=0.61處，可把28份扁穗牛鞭草分為2個類群，其中來自貴

24、州的3個材料H042、H043、H047聚為一類(第類)；剩下的所有材料聚為一類(第類)，均來自重慶和四川的材料，這與重慶和四川地理位置很接近，生境比較相似有一定關系。另外，結合陳永霞等對供試牛鞭草材料的形態(tài)聚類分析21，又可將28份材料分為4組。第類均為較纖細低矮型(A組)；在第類中，H019、H031、“重高”為粗壯低矮型(B組)，H001、H016、H026、H029、H033、H040、H035、H053、H054、H05為最纖細最低矮的類型(C組)，YA2002-2、YA2002-4、YA2002-5、YA2003-1、YA2003-2、YA2003-3、YA2003-4、YA200

25、3-5、YA2003-6、H002、H065、“廣益”為高大粗壯型(D組)，且“廣益”扁穗牛鞭草的無性選系全部聚在一起。從聚類結果可以看出，相同或相近地理來源的材料基本聚在一起，說明遺傳多樣性與其地理來源有一定關系；其次，同一形態(tài)類型的扁穗牛鞭草材料也基本聚在一起，其遺傳多樣性與其形態(tài)多樣性相吻合。2.6扁穗牛鞭草主成分分析 對28份扁穗牛鞭草種質的ISSR標記的原始矩陣進行主成分分析，前3個主成分所能解釋的遺傳變異分別為18.52%、11.49%和9.64%。對28份種質做前3個主成分的三維排序圖（圖3），位置靠近者表示關系密切，遠離者表示關系疏遠，將位置靠近的扁穗牛鞭草材料劃歸在一起，可將

26、供試材料分成4個組，與聚類分析結果基本一致。圖3 依據(jù)ISSR標記對扁穗牛鞭草種質進行主成分分析的三維散點圖Fig.3 The 3 dimensions plot of the principal components analysis on H. compressa accessions with ISSR markers3.討論與結論 對來源于四川、重慶、貴州地區(qū)的28份扁穗牛鞭草材料進行ISSR分子標記遺傳多樣性分析的結果表明，平均每個引物擴增的多態(tài)條帶數(shù)為8.5條，多態(tài)性條帶比率為84.2%；材料間遺傳相似系數(shù)范圍在0.466到0.98間，平均GS值為0.722，從而在DNA分子水平上

27、說明了不同扁穗牛鞭草種質材料(無性系)之間的遺傳差異較大，遺傳多樣性較豐富。聚類分析和主成分分析結果顯示，28份扁穗牛鞭草材料可劃分為2大類4組，這與形態(tài)學的劃分基本一致，但同屬C組的H001在ISSR聚類圖上與C組其它材料明顯分屬2個聚類群，這說明形態(tài)學數(shù)據(jù)由于數(shù)量有限、且易受環(huán)境影響，不足以表明扁穗牛鞭草種質的所有多樣性。一般而言，對扁穗牛鞭草等以無性繁殖為主的牧草，宜采用無性系的系統(tǒng)選擇來進行品種選育，因而建立快速的品種指紋圖譜對于加快育種進程和新品種保護具有重要意義。從本研究的結果看，利用ISSR標記技術可以獲得清晰且多態(tài)性高的扁穗牛鞭草電泳圖譜。利用單獨一個多態(tài)性好的引物基本上能將2

28、8份材料分開，且各材料特征帶明顯，說明ISSR標記用于扁穗牛鞭草遺傳多樣性研究及不同材料的DNA水平識別是可靠的，這為利用ISSR技術構建扁穗牛鞭草品種的指紋圖譜，保護產權和輔助育種奠定了良好基礎。另外，本研究發(fā)現(xiàn)來自“廣益”的無性系選系間存在一定的變異，這可能是由于長期種植后，自然條件及栽培環(huán)境等的變化所產生的基因變異，這為在優(yōu)良扁穗牛鞭草品種中進一步選育提供了理論依據(jù)。 參考文獻：1 中國科學院植物所.中國植物志(第十卷,第二分冊)M.北京:科學出版社,1997,10(2):262.2 張健,黃勇富,張家驊,等.扁穗牛鞭草生產及利用的發(fā)展現(xiàn)狀和潛力J.草業(yè)科學,2003,20(7):161

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31、association emtlon: I. Effects of H. altissima (Poir.) stapf. and Hubb root residues on the growth of Desmodium miortum (Mill.). urb. and H. altissima in a tropical soil J. CropScience, 1981, 2l (5):770774. 9 Zietikiewicze, Rafalske R A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (ISS

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