淺論甲氨蝶呤對(duì)假孕大鼠輸卵管組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響

1、淺論甲氨蝶呤對(duì)假孕大鼠輸卵管組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響               作者：陳燕萍，鄭飛云，楊孝軍，王漢楚【摘要】  目的：觀察不同劑量甲氨蝶呤(MTX)對(duì)假孕SD大鼠輸卵管組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的急性期及遠(yuǎn)期損傷。方法：72只SD雌性大鼠，致假孕狀態(tài)后再行MTX腹腔注射：1 mg/kg組()、2 mg/kg組()、5 mg/kg組(III)及腹腔注射生理鹽水對(duì)照組，每組18只。10 d、2個(gè)月后分別殺取各組半數(shù)大鼠的輸卵管壺腹部組織，行常規(guī)組織學(xué)和透

2、射電鏡檢測(cè)。結(jié)果：光鏡下MTX處理后10 d的各組輸卵管標(biāo)本中，均出現(xiàn)輸卵管間質(zhì)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并隨MTX劑量增大而加重，且組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至輸卵管上皮全層，對(duì)照組則無(wú)明顯改變。急性期輸卵管炎癥在2個(gè)月后逆轉(zhuǎn)為正常。透射電鏡下MTX處理后10 d的各組輸卵管標(biāo)本中，均出現(xiàn)上皮細(xì)胞纖毛消失或減少，并隨MTX劑量增大而加重，但組的纖毛消失在2個(gè)月后表現(xiàn)為可逆，組、的損傷在2個(gè)月后表現(xiàn)為不可逆。且組在10 d及2個(gè)月的標(biāo)本中，均出現(xiàn)纖毛細(xì)胞內(nèi)線粒體水腫、空泡形成及結(jié)晶樣物質(zhì)形成;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并有電子致密物沉積;細(xì)胞核固縮;無(wú)纖毛細(xì)胞頂部的分泌顆粒代償性增加。而對(duì)照組則無(wú)明顯改變。結(jié)論 ：MTX

3、作用后的輸卵管出現(xiàn)了近期及遠(yuǎn)期、可逆或不可逆性的結(jié)構(gòu)及功能的損傷，且損傷效應(yīng)存在一定的量-效關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  甲氨蝶呤;輸卵管;組織學(xué);超微結(jié)構(gòu)Abstract: Objective: To investigate the acute and long-term injury of different doses of methotrexate (MTX) on histologiy and ultrastructure of osalpinx in pseudocyesis rats. Methods: Seventy-two SD pseudocyesis rats were

4、 randomly divided into 4 groups (n=18). Increasing doses of MTX were administrated to the rats by intraperitoneal injection: 1 mg/kg in group I， 2 mg/kg in group II and 5 mg/kg in group III. Rats were only received injections of physiological saline as control groups. Ten days and 2-month after drug

5、 injection， half of rats in each group were killed respectely and the fallopian tubes were removed and submitted to examination under light and transmission electron microscope (TEM). Results: Numerous infiltration of inflammatory cells within submucous membrane could be seen in the samples of ten d

6、ays after MTX treatment under light microscopy. And it was serious with increasing doses of MTX. In group III，inflammatory cell infiltrated could be observed to epithelial lamina coule be seen. And In the control group the condition of all surface structures seemed normal.Yet， all surface structures

7、 returned to normal condition after 2-Month. In all samples of ten days after MTX treatment， ultrastructural examination showed loss of cilia in epithelial cells which was serious with increasing doses of MTX. Cilial decrease or loss from epithelial cells returned to normal condition after 2-Month i

8、n group I，while it was irreversible in group II and III. In group III， extensived crystalloid formation could be also observe and vacuolization occurred within the mitochondria; rough endoplasmic reticulum dilation and electron-dense mass deposited ; karyopyknosis occurred ;secretory granules on the

9、 top of the cilial was compensatorily increased. such ultrastructural changes cant return to normal after 2-Month. But no obvious change could be found in the control group. Conclusion:Histological and ultrastructural alternations do occur within fallopian tubes resulting from MTX. Such complication

10、s can attribute to certain degree doses of MTX.Key words: methotrexate;osalpinx;histology;ultrastructure甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是輸卵管妊娠的藥物保守治療中常用和首選的藥物，該藥可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增生，破壞絨毛，促使胚胎組織壞死、脫落，從而達(dá)到保守治療輸卵管妊娠的目的1。對(duì)于MTX保守治療輸卵管妊娠的確切療效，對(duì)輸卵管的損傷以及對(duì)后續(xù)妊娠的影響情況，目前多限于臨床觀察，各家報(bào)道結(jié)果不一2-3。我們首次系統(tǒng)研究不同劑量MTX對(duì)雌性假孕SD大鼠輸卵管黏膜組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的急性損傷

11、和遠(yuǎn)期恢復(fù)效應(yīng)，以及可能的量-效關(guān)系，并進(jìn)一步探討MTX治療后的輸卵管損傷對(duì)后續(xù)妊娠的潛在影響。1 材料和方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雌性未孕SD(Sprague Dawley)大鼠72只，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。甲氨蝶呤針劑購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)07020512);妊馬血清促性腺激素針劑(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG) 購(gòu)自杭州動(dòng)物藥品廠(批號(hào)060417)。人絨毛膜促性腺激素針劑(human chorionic gonadotropin，HCG) 購(gòu)自麗珠集團(tuán)制藥廠(批號(hào)070307)。1.2 方法2 結(jié)果所有假孕SD大鼠在處

12、理后的10 d及2個(gè)月內(nèi)均未觀察到明顯的異常行為，在實(shí)驗(yàn)取材過(guò)程中，各組大鼠的輸卵管大體解剖均未發(fā)現(xiàn)明顯的肉眼改變。2.1 光鏡下的形態(tài)學(xué)改變 MTX處理后10 d的輸卵管標(biāo)本中，組I光鏡下可見(jiàn)輸卵管內(nèi)膜的柱狀上皮細(xì)胞無(wú)明顯改變，間質(zhì)輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1A)。組II和組III中的輸卵管內(nèi)膜柱狀上皮與間質(zhì)均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)程度較組I更明顯(見(jiàn)圖1B)，組III中還可見(jiàn)到少量的嗜酸性粒細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至上皮全層內(nèi)(見(jiàn)圖1C)。炎性反應(yīng)隨MTX作用劑量增大而加重。但這些急性期的炎性改變?cè)?個(gè)月后對(duì)應(yīng)MTX劑量組的輸卵管標(biāo)本中出現(xiàn)遠(yuǎn)期可逆現(xiàn)象，可恢復(fù)至近似正常結(jié)構(gòu)。而對(duì)照組輸卵管

13、的光鏡下結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變(見(jiàn)圖1D)。2.2 電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變 大鼠輸卵管黏膜上皮主要由纖毛細(xì)胞和無(wú)纖毛細(xì)胞組成。對(duì)照組輸卵管黏膜可見(jiàn)正常密集的纖毛細(xì)胞和無(wú)纖毛細(xì)胞。MTX處理后10 d的輸卵管標(biāo)本，在組I、II、III中均出現(xiàn)纖毛細(xì)胞的纖毛減少或缺失(見(jiàn)圖2A)，組I改變較輕，但隨MTX劑量增大，組II、III纖毛減少的程度亦加重;且組I的纖毛減少在2個(gè)月后出現(xiàn)了遠(yuǎn)期可逆現(xiàn)象，但組II、III的的纖毛減少或缺失在2個(gè)月后的觀察時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為不可逆。此外，組III在10 d及2個(gè)月的標(biāo)本中，還出現(xiàn)纖毛細(xì)胞內(nèi)的線粒體水腫、空泡形成(見(jiàn)圖2B)及細(xì)胞核固縮，線粒體中央的結(jié)晶樣物質(zhì)形成(見(jiàn)圖2C)，

14、部分細(xì)胞核的核膜孔間隙擴(kuò)大，無(wú)纖毛細(xì)胞頂部的分泌顆粒代償性增加(見(jiàn)圖2D)，組III的這些改變?cè)谟^察時(shí)間內(nèi)均表現(xiàn)為不可逆。         3 討論大鼠輸卵管黏膜上皮主要由纖毛細(xì)胞和無(wú)纖毛細(xì)胞組成，纖毛細(xì)胞比較集中分布于皺襞頂部，纖毛高度與擺動(dòng)朝向一致，無(wú)纖毛細(xì)胞零星散在于纖毛細(xì)胞間，這些結(jié)構(gòu)與其拾卵或輸送受精卵的功能相適應(yīng)。目前關(guān)于MTX對(duì)輸卵管損傷的研究多集中在形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變上，且結(jié)論不一，如黃健等認(rèn)為示輸卵管注射MTX早期可引起輸卵管內(nèi)膜間質(zhì)的水腫和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，但其影響輕微、相對(duì)短暫，對(duì)輸卵管本身的結(jié)構(gòu)

15、未造成不可逆的損害;最近Bayram等的研究證實(shí)一定濃度的甲氨蝶呤，可對(duì)正常大鼠輸卵管黏膜上皮造成定一定程度的急性損傷，改變黏膜層的組織學(xué)超微結(jié)構(gòu)，且提示MTX可能會(huì)影響纖毛細(xì)胞的功能。但該研究未闡明輸卵管黏膜急性損傷后的遠(yuǎn)期恢復(fù)情況，以及是否存在一定的量-效關(guān)系。本研究則從大鼠輸卵管組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)兩個(gè)層面，綜合研究MTX對(duì)輸卵管黏膜的急性損傷和遠(yuǎn)期恢復(fù)效應(yīng)。研究表明輸卵管黏膜的光鏡下急性炎性反應(yīng)隨MTX劑量增大而加重，且各劑量組處理后的輸卵管急性期的炎性改變?cè)?個(gè)月后出現(xiàn)遠(yuǎn)期可逆現(xiàn)象，輸卵管可恢復(fù)至近似正常的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。透射電鏡下還觀察到低劑量組(1 mg/kg)的黏膜上皮纖毛細(xì)胞損傷在2

16、個(gè)月后出現(xiàn)了遠(yuǎn)期可逆現(xiàn)象，但大劑量的組II、III中的纖毛細(xì)胞減少及缺失在2月后的觀察時(shí)間內(nèi)卻表現(xiàn)為不可逆，不僅影響輸卵管上皮層的纖毛細(xì)胞，導(dǎo)致纖毛細(xì)胞數(shù)量或質(zhì)量的減少，并且大劑量組還出現(xiàn)了諸多細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的損傷，諸如：部分細(xì)胞核固縮，核膜間隙擴(kuò)大，線粒體水腫及結(jié)晶樣物質(zhì)沉淀，無(wú)纖毛細(xì)胞呈現(xiàn)嚴(yán)重的代償性分泌增加，均為不可逆性改變。可見(jiàn)，光鏡下輸卵管的炎性改變遠(yuǎn)期可逆，但電鏡下輸卵管組織中諸多超微結(jié)構(gòu)的損傷在觀察期限內(nèi)，仍難以完全恢復(fù)至正常。本研究提示，小劑量MTX治療可能會(huì)對(duì)輸卵管結(jié)構(gòu)造成一定的急性損傷，但遠(yuǎn)期可逆，而逐漸增大MTX劑量時(shí)，會(huì)對(duì)輸卵管黏膜結(jié)構(gòu)，特別是輸卵管上皮層的纖毛細(xì)胞產(chǎn)生

17、不可逆的遠(yuǎn)期損傷。通常，輸卵管黏膜的諸多結(jié)構(gòu)如纖毛細(xì)胞等對(duì)拾卵或輸送受精卵的功能起重要作用，纖毛高度與擺動(dòng)朝向一致，有效的擺動(dòng)能將受精卵向子宮方向運(yùn)輸，如果纖毛減少或缺失，或?yàn)槔w毛活動(dòng)提供所需ATP的線粒體中出現(xiàn)不同程度的空泡和結(jié)晶形成，均會(huì)使纖毛擺動(dòng)顯著減弱，且輸卵管炎癥及無(wú)纖毛細(xì)胞代償性分泌增加均可影響其通暢，延緩受精卵在輸卵管內(nèi)的移行過(guò)程，形成新的致病因素，對(duì)后續(xù)妊娠造成一定的影響，導(dǎo)致治療后不孕或再次宮外孕的發(fā)生?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Barnhart K T, Gosman G, Ashby R, et al. The Medical Man-agement of Ectopi

18、c Pregnancy: A Meta-Analysis Compar-ing "Single Dose" And "Multidose" Regimens J. ObstetGynecol, 2003, 101 (4): 778-784.Gervaise A,Masson L,DE Tayrac R, et al. ReproductiveOutcome after Methotrexate Treatment of Tubal Pregnan-ciesJ. Fertil Steril, 2004, 82 (2): 304-308.Weiden R M,Karsdorp VH. Recurrent Cornual Pregnancyafter Heterotopic Cornual Pregnancy Successfully T