晶體表面結(jié)合蛋白對(duì)草酸鈣晶體生長的抑制作用

1、    晶體表面結(jié)合蛋白對(duì)草酸鈣晶體生長的抑制作用        摘要為觀察晶體表面結(jié)合蛋白(CSBP)對(duì)草酸鈣晶體生長的影響，用層析法分離提取正常人和草酸鈣結(jié)石病人CSBP，應(yīng)用種晶體技術(shù)檢測CSBP、尿凝血酶原激活肽F1片段(UPTF1)和白蛋白在體外對(duì)草酸鈣晶體生長的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人CSBP和UPTF1能顯著抑制草酸鈣晶體的生長，結(jié)石病人CSBP的抑制活性低于正常人。提示病人CSBP中UPTF1減少致抑制活性降低與結(jié)石形成有關(guān)。關(guān)鍵詞尿結(jié)石草酸鈣 

2、0;   In vitro inhibition of calcium oxalate crystal growth by crystal surface binding proteinsZhu Shaoxing,Zhang Yongshang,Liu Jihong,et al.Department of Urology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030AbstractCrystal surface binding proteins(CSBP) were isolated by chromatogr

3、aphy.The effects of proteins on calcium oxalate crystal growth in vitro were tested using a seeded crystallization technique.It was observed that CSBP and urinary prothrombin F1(UPTF1) of normal subjects could apparently inhibit calcium oxalate crystal growth.CSBP of stone formers showed lower inhib

4、itory activity than that of normal.The inhibitory activity of albumin,whether in normal subjects or in stone formers,was weak.It was concluded that UPTF1 is a potent inhibitor of calcium oxalate crystal growth.A dificiency of UPTF1 in CSBP of stone formers may be related to calculogenesis.Key wordsU

5、rinary calculiCalcium oxalate     本課題為國家教委資助課題作者單位：430030 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科(朱紹興現(xiàn)在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科)新鮮草酸鈣晶體表面結(jié)合物質(zhì)(CSBS)主要由蛋白質(zhì)和葡胺聚糖兩類物質(zhì)組成，有關(guān)它們?cè)诮Y(jié)石形成初始階段的作用是近年來人們關(guān)注的問題之一1，2。我們觀察了其中的蛋白質(zhì)組分在體外對(duì)草酸鈣晶體生長的抑制作用，并對(duì)正常人和結(jié)石病人蛋白質(zhì)的抑制活性加以比較。報(bào)告如下。 材料與方法一、草酸鈣晶體表面結(jié)合物質(zhì)的制備收集8例正常男性(2435歲)和8例男性草酸鈣結(jié)石病人(28

6、43歲)尿液，按文獻(xiàn)方法制備晶體表面結(jié)合物質(zhì)3。二、晶體表面結(jié)合物質(zhì)中蛋白質(zhì)的分離DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析法分離CSBS中的蛋白質(zhì)和葡胺聚糖，羥基磷灰石吸附層析法進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)的各個(gè)組成部分4。三、晶體表面結(jié)合蛋白對(duì)草酸鈣晶體生長體外抑制活性的測定取pH6.5的Tris緩沖液48ml，置37恒溫結(jié)晶器內(nèi)，加0.03mol/L CaCl2和0.03mol/L Na2C2O4各1ml?；靹虻?.6mol/L的草酸鈣亞穩(wěn)過飽和溶液50ml。實(shí)驗(yàn)分四組：A組加CSBP，使蛋白終濃度為10mg/L；B組加白蛋白，蛋白濃度10mg/L；C組加正常人尿凝血酶原激活肽F1片段(U

7、PTF1)，使蛋白終濃度分別為0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mol/L；D組加等量雙蒸水為對(duì)照。10分鐘后取樣3ml經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾于試管中。加一水草酸鈣籽晶0.5ml(5mg/ml)，攪拌30秒后孵化3小時(shí)，各取樣3ml過濾于試管中。原子吸收分光光度計(jì)測濾液中Ca的吸光度(A)，按下式計(jì)算各蛋白質(zhì)組分對(duì)草酸鈣晶體生長的抑制指數(shù)(I.I)。I.I=(1-(AoAt)/(AoAc)×100%上式中Ao為加籽晶前濾液中Ca+的吸光度；Ac、At分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加籽晶孵育后濾液中Ca的吸光度。結(jié)果一、蛋白質(zhì)層析分離結(jié)果CSBS中主要含蛋白質(zhì)和葡胺聚糖兩類大分子

8、物質(zhì)；正常人CSBP含UPTF1和白蛋白；病人的CSBP以白蛋白為主，UPTF1含量明顯低于正常人。二、各組分對(duì)草酸鈣晶體生長的抑制活性正常人和結(jié)石病人CSBP的抑制指數(shù)分別為42.3%和19.2%，有顯著性差異；白蛋白的抑制活性較低，分別為15.4%和11.5%。正常人UPTF1的作用呈劑量依賴性，UPTF濃度為0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mg/L時(shí)，其I.I值依次為11.5%、15.4%、23.1%、42.3%和53.8%。討論基質(zhì)約占草酸鈣結(jié)石干重的2%6%，其中可溶成分僅25%左右?；|(zhì)提取過程，老化、結(jié)石生長過程中尿液大分子物質(zhì)組成的變化等均可影響基質(zhì)化合物的組成

9、和分子結(jié)構(gòu)。為了避免上述因素的干擾，采用草酸鈣過飽和結(jié)晶法制備新鮮晶體表面結(jié)合物質(zhì)，研究結(jié)石形成初始階段基質(zhì)的組成成分及其對(duì)成石的作用，發(fā)現(xiàn)尿液中的凝血酶原激活肽F1片段和葡胺聚糖等物質(zhì)能選擇性地結(jié)合到草酸鈣晶體表面4，5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道結(jié)果類似，不同之處在于除UPTF1外，晶體表面結(jié)合物質(zhì)中還含有較多白蛋白。造成這種差異的原因可能是本實(shí)驗(yàn)中所采用的孵化時(shí)間較長，使白蛋白有充分的時(shí)間吸附到晶體表面。UPTF1通過-羧基谷氨酸殘基與鈣離子的作用快速結(jié)合到含鈣晶體上，白蛋白則以較緩慢的物理方式與晶體結(jié)合。尿液大分子物質(zhì)是結(jié)石基質(zhì)的組分或重要前體，它可通過誘導(dǎo)和促進(jìn)異質(zhì)成核，提供晶體生長和聚集的模

10、板，覆蓋晶體表面防止重新溶解等作用而促進(jìn)結(jié)石形成。也可封閉晶體表面活性生長位點(diǎn)或改變晶體表面電荷與能量分布，抑制結(jié)晶的生長和聚集。Koide等1認(rèn)為晶體表面結(jié)合物質(zhì)是草酸鈣結(jié)晶生長和聚集的抑制因子；Ryall等5將晶體表面結(jié)合物質(zhì)進(jìn)一步純化、分離后發(fā)現(xiàn)，其主要組分蛋白質(zhì)和葡胺聚糖均可抑制草酸鈣晶體的生長和聚集，其中所含的UPTF作用最強(qiáng)。同位素示蹤和掃描電鏡觀察證實(shí)UPTF通過結(jié)合到晶體表面而發(fā)揮抑制作用。白蛋白是尿液中含量最多的血清蛋白質(zhì)，能抑制草酸鈣晶體的成核和聚集，對(duì)晶體生長的抑制活性很低6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CSBP、UPTF1和白蛋白均能在體外抑制草酸鈣結(jié)晶生長，UPTF1作用最強(qiáng)，其

11、抑制活性呈劑量依賴性，白蛋白抑制作用較弱。說明UPTF1的作用構(gòu)成CSBP抑制活性的主體，提示UPTF1可能在影響結(jié)石形成方面占有比較重要的地位。Drach等7報(bào)道結(jié)石病人尿液抑制活性低下，其中促進(jìn)結(jié)晶生長聚集作用的高、中分子量蛋白質(zhì)含量高于正常人，而主要起抑制作用的低分子量蛋白質(zhì)含量減少；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)石病人尿中腎鈣素、TH蛋白等抑制物的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì)草酸鈣晶體生長和聚集的抑制作用也相應(yīng)降低8，9。推測尿液大分子物質(zhì)組成和功能的變異與結(jié)石形成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持這種推測，結(jié)石病人CSBP的抑制活性低于正常人，白蛋白的作用與正常人相似。分析CSBP的組成后，我們認(rèn)為UPTF1缺乏是導(dǎo)

12、致病人CSBP抑制活性低下的重要原因。應(yīng)用外源性葡胺聚糖類物質(zhì)防治泌尿系結(jié)石已取得一定進(jìn)展10，11。可以預(yù)計(jì)，對(duì)尿液中蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)的研究除了有助于更清楚地認(rèn)識(shí)尿石癥的發(fā)病機(jī)制外，還能為臨床上尋找有效的結(jié)石防治方法提供理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。參考文獻(xiàn)1Koide T,Yoshioka T,Yamaguchi S,et al.Urinary crystal surface binding substances on calcium oxalate crystals.Urol Res,1990,18387-392.2Doyle IR,Marshall VR,Dauson CJ,et al.Cal

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