植物組織培養(yǎng)中的細胞分化與器官建成

1、植物組織培養(yǎng)中的細胞分化與器官建成(一植物細胞的全能性植物細胞的全能性即是每個植物的本細胞或性細胞都具有該植物的全套遺傳基因,因此在一定培養(yǎng)條件下每個細胞都可發(fā)育成一個與母體一樣的植株。這個概念雖然在本世紀(jì)初已經(jīng)提出,但在當(dāng)時的技術(shù)條件下,在實踐上并沒做到,經(jīng)過幾十年來組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進,目前細胞的全能性不但在理論上完全被證實,而且為組織培養(yǎng)在實踐上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。植物細胞要表現(xiàn)出全能性,須經(jīng)過幾個步驟:成熟細胞分生細胞胚狀體完整植株。成熟細胞愈傷組織出根出芽完整植株。脫分化也就是已經(jīng)分化定型的細胞,經(jīng)過誘導(dǎo)成為重新恢復(fù)了分裂能力(也就是成為分生狀態(tài)細胞的過程。不但植物體細胞可以表現(xiàn)全能

2、性,花粉在培養(yǎng)條件下也可能進行脫分化,通過愈傷組織或胚狀體發(fā)育成單倍體植株。植物細胞為什么表現(xiàn)出全能性呢?就要從動物與植物細胞的區(qū)別說起。不論是植物、動物還是微生物,其代謝的分子基礎(chǔ)基本是一樣的,從微生物到人,遺傳的信息是一致的。但動物與植物細胞區(qū)別還是很大的這差別主要地在于:第一,自養(yǎng)與異養(yǎng)的差別。高等綠色植物是自養(yǎng)的,對營養(yǎng)的要求較簡單,因此培養(yǎng)基的成分大部分為無機物和少量簡單有機物。而高等動物是需要多種復(fù)雜營養(yǎng)的異養(yǎng)生物,它們從復(fù)雜的來源中吸收、消化和同化其營養(yǎng),并通過血液將養(yǎng)分輸送到全身細胞和器官。第二,外界環(huán)境的差別。動物細胞直接所處的內(nèi)部環(huán)境,以上對濃縮的形式來滿足其營養(yǎng)要求。植物

3、所處的環(huán)境變化大,它中收養(yǎng)分是以稀釋的狀態(tài)。植物細胞束縛在纖維素壁內(nèi),內(nèi)部液泡保持相當(dāng)穩(wěn)定的成分。植物細胞又以很大的能力維持著大的液泡、原生質(zhì)與外界培養(yǎng)基進行物質(zhì)交換。第三,胚胎得到養(yǎng)分的方式不同。動物的胚靠預(yù)先存在卵里的營養(yǎng)發(fā)育,靠胎座與母體聯(lián)系,植物的胚獲得營養(yǎng)方式相對地簡單,胚存在于胚囊和胚株中,通過胚乳供應(yīng)胚的養(yǎng)分,原胚與子葉通過其外表面吸收養(yǎng)分。所以植物細胞誘導(dǎo)成胚從外部取得營養(yǎng)容易,不象動物要通過血液。第四,器官發(fā)育的差別。動物很早就開始器官發(fā)育,這些器官有高度特化的功能,然后靠血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、脊髓、大腦、激素把各器官連成整體。并且動物器官的發(fā)育過程基本上只有一次,而高等植

4、物重復(fù)地產(chǎn)生器官而且是無限的。植物器官的發(fā)育是在生長區(qū)通過活細胞的活動,如頂端分生組織不斷產(chǎn)生葉、芽、花,在這些具有活細胞的部位,可取活細胞進行移植和培養(yǎng)。誘導(dǎo)細胞的脫分化,需要許多外界條件。任何一個分化的細胞都具有保持分生組織狀態(tài)的潛勢,不過它平常處于受抑制的狀態(tài),消除抑制作用就可以使細胞恢復(fù)分裂。在各種外界條件中,外源激素對脫分化起重要作用。有些植物的外植體僅需加入生長素(IAA吲哚乙酸, NAA萘乙酸,2,4-D即可誘導(dǎo)細胞的分裂與生長,如菊苣;有的僅需加入加細胞激動素類,如大豆、蘿卜;另一類需加生長素和細胞激動素類,如煙草髓、胡蘿卜、馬鈴薯;還有一類不需加任何激素,如冠癭組織,煙草腫瘤

5、組織。(二組織的分化與器官建成1、維管組織的分化早期研究發(fā)現(xiàn)(Wetmore,1955,丁香的芽可以誘導(dǎo)鄰近的組織分化出維管束,后證明這是芽中IAA的作用。將一塊含有14C-IAA 和蔗糖的瓊膠楔形物插入到愈傷組織切口中, 14C-IAA表明蔗糖和IAA通過瓊膠擴散到愈傷組織,從而在愈傷組織中造成這兩種物質(zhì)的梯度,在楔形物一頗有同感形成維管束的瘤狀物,瘤狀物含有一形成層帶,一面形成韌皮部,一面形成木質(zhì)部,與正常的維管束有類似的排列。增加IAA的濃度,導(dǎo)致木質(zhì)部形成,增加蔗糖濃度則導(dǎo)致韌皮部形成。生長素水平恒定時,2%蔗糖則全部分化出木質(zhì)部,4%蔗糖幾乎全部分化出韌皮部,3%蔗糖則可以分化出二者

6、。所以,生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。Rier和Beslow進一步報道,蔗糖不僅影響細胞的數(shù)目,而且影響其結(jié)構(gòu)。低濃度蔗糖(0.5%誘導(dǎo)出環(huán)紋和梯紋管胞,1.5-3.-5%蔗糖誘導(dǎo)出梯紋和網(wǎng)紋細胞。細胞分裂素類對促進木質(zhì)部形成也有作用。它們使碳水化合物代謝趨向于五碳糖途徑,促進木素前體苯丙烷的合成,不同的細胞分裂素作用不同。玉米素激動素6-BA(6-芐基腺嘌呤,NAA/激動素的比值為0.5/20時有木質(zhì)部發(fā)生和根形成,而比值降為0.025/0.4時,只發(fā)生木質(zhì)部而不發(fā)生根,赤霉素(GA、乙烯、脫落酸對木質(zhì)部發(fā)生有抑制作用。2、根和芽的分化外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后,經(jīng)過繼代培養(yǎng)

7、,可以在愈傷組織內(nèi)部形成一類分生組織(meristemoid即具有分生能較往年小細胞團,然后,再分化成不同的器官原基。有些情況下,外植體不經(jīng)愈傷組織而直接誘導(dǎo)出芽、根。所以器官發(fā)生有兩種方式,即直接和間接的。(1外植體器官發(fā)生(根、芽或胚狀體再生植株。(2外植體愈傷組織類分生組織根、芽再生植株。根是組織培養(yǎng)中易形成的器官,早在30年代,就看以胡蘿卜培養(yǎng)物中根的形成,以后又在多種植物中看到,同一植物不同器官可以誘導(dǎo)出根來:如棉花幼苗子葉、下胚軸切段、油菜葉片、葉柄、下胚軸等,多種植物愈傷組織也易生根。形成芽的培養(yǎng)基條件常有不同,有時芽與根可以同時在組織培養(yǎng)中形成,一般說,培養(yǎng)物中形成的芽如胡蘿卜

8、懸浮培養(yǎng),油菜愈傷組織等。在組織培養(yǎng)中通過根、芽誘導(dǎo)再生植株方式有三種:一種在芽產(chǎn)生之后,于芽形成的基部長根而形成小植株,一種是在根上生長出芽來,另一種即在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根,然后兩者結(jié)合起來形成一株植物。除營養(yǎng)芽之外,在組織培養(yǎng)中有時也有花芽的形成,如煙草、花生等。也有變態(tài)器官的形成,如百合鱗片切塊分化出的芽,形成小鱗莖,唐菖蒲莖端可誘導(dǎo)形成小球莖,馬鈴薯的莖切段可以形成塊莖。植物激素的成分影響著器官建成,Skoog和Miller等所提出的生長素和激動素比例決定根和芽分化的觀點,曾被大量的試驗結(jié)果所證明。在很多禾谷類作物的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),用較高濃度的生長素(2,4-D誘導(dǎo)形成的

9、愈傷組織,當(dāng)培養(yǎng)在除去生長素,或適當(dāng)濃度的活性較低的生長素中時,就可以誘導(dǎo)芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM培養(yǎng)基附加10-5摩爾2,4-D培養(yǎng)水稻愈傷組織可以生根,一旦轉(zhuǎn)入無生長素的培養(yǎng)基時就能產(chǎn)生芽。Rangan將小米愈傷組織從含生長素的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基,一個星期內(nèi)就形成了芽。但在另一些例子中激素比例控制器官分化的問題則出現(xiàn)完全相反的情況。苜蓿在有2, 4-D和細胞分裂素的培養(yǎng)基中,可以形成愈傷組織,轉(zhuǎn)入不加以上兩種激素的培養(yǎng)基中能分化,但分化的情況與原來的激素比例有關(guān)。如果愈傷組織是在高細胞分裂素/生長素比例的培養(yǎng)基中形成的,易于生根,而在高生長素/細胞分裂素

10、比例的培養(yǎng)基中形成的,易于生根,而在高生長素/細胞分裂素比例的培養(yǎng)基中形成的愈傷組織,則易生芽。由此看來,分化與激素的關(guān)系同植物的遺傳性有著密切的關(guān)系,用五個品種的煙草做實驗,用相同的生長素/細胞分裂素比例,結(jié)果有的品種形成很多芽,有的形成很少芽,有的完全不生芽。培養(yǎng)基的物理因素和外界條件對器官建成有一定影響。固體培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)愈傷組織,而液體培養(yǎng)基有利于細胞和胚狀體增殖。藍光有利于芽的分化,而紅光、遠紅光對芽分化有抑制作用,但促進根分化,紫光對生芽有刺激作用。石刁柏、虎耳草屬、鳳梨科植物分化前期需要低光強(1000勒克斯,后期要求高光強(3000-10000勒克斯,降低氧濃度促進胡蘿卜愈傷

11、組織芽的形成,增加氧濃度促進不定根形成。3、胚狀體是指在組織培養(yǎng)呂從一個非合子細胞,通過合子胚相似的胚胎發(fā)生過程所形成的胚狀結(jié)構(gòu)。從胚狀體可以形成完整的植株,這是植株細胞全能性的最強有力的一個證據(jù)。50年代末期,Steward等人從胡蘿卜的韌皮部用液體培養(yǎng)基通過游離細胞的分化,獲得了胚狀體。據(jù)統(tǒng)計,在植物組織培養(yǎng)中具有胚狀體分化能力的種子植物已達117種,分屬43科, 75屬(見遺傳學(xué)報5卷1期,1980年。在植物組織組織培養(yǎng)中,誘導(dǎo)胚狀體與誘導(dǎo)芽相比較,具有顯著的優(yōu)點,一是數(shù)量多,二是速度快,三是成苗率高。由于胚狀體具有這些優(yōu)點,所以在育種工作及園藝工作中,可用胚狀體作為特定的優(yōu)良基因型個體的無性繁殖手段,同時在研究胚胎發(fā)育中也有很重要的理論意義。培養(yǎng)基的激素成分和氮源影響胚狀體的發(fā)生。有的植物可在無激素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚狀體,如煙草、曼陀蘿、水稻、小麥花藥培養(yǎng);有的植物需要生長素與細胞分裂素的一定比例誘導(dǎo)胚狀體,如油茶、酸棗、桃等。石龍芮下胚軸,石刁柏愈傷組織,還有一些植物先在有激素的培養(yǎng)基上,然后轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體。有人證明培養(yǎng)基