淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方案

1、目和相對(duì)比例都在一定的范圍內(nèi)。那么臨床常見(jiàn)的淋巴細(xì)胞亞群包括哪些項(xiàng)目?一、淋巴細(xì)胞亞群二、抗體組合方案聯(lián)合CD45的三色方案主要是有四種不同的試劑。1.CD45/CD3/CD4這個(gè)抗體組合主要用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和T4細(xì)胞。2.CD45/CD3/CD8用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和T8細(xì)胞。3.CD45/CD3/CD19用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和B細(xì)胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和NK細(xì)胞。(三雙色方案如果實(shí)驗(yàn)室在邊遠(yuǎn)的地區(qū),條件不足,只能做雙色方案,但是在雙色方案中建議要把CD3加進(jìn)來(lái),因?yàn)镃D45能很好地將白細(xì)胞和其他的干擾細(xì)胞,尤其是紅細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。如果不能用CD45,最好能用

2、到CD3,CD3可以特異的標(biāo)記T淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞和CD4做雙標(biāo)可以克服單一的CD4抗體。為此,雙色方案中也分為四管,每管當(dāng)中建議都包含有CD3。1.CD3/CD4用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和T4細(xì)胞。2.CD3/CD8用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和T8細(xì)胞。3.CD3/CD19用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和B細(xì)胞。4.CD3/CD16和/或CD56用來(lái)檢測(cè)T3細(xì)胞和NK細(xì)胞。盡管檢測(cè)條件不允許做四色或三色的分析,但也至少要用CD3和其他的直標(biāo)抗體進(jìn)行雙免疫熒光染色方案,不建議采用單色方案進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析。(四7-氨基放線菌素D(7-AAD聯(lián)合CD45方案1.目的對(duì)于超過(guò)24小時(shí)的標(biāo)本或肉眼觀察發(fā)現(xiàn)已經(jīng)變質(zhì)的標(biāo)本,需使用

3、7-氨基放線菌素D(7-AAD結(jié)合CD45(評(píng)估淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞死亡復(fù)染評(píng)估細(xì)胞活力。2.判定7-AAD熒光染料主要染活細(xì)胞,主要用來(lái)鑒定細(xì)胞活性。(17-AAD陰性者是活細(xì)胞群。(27-AAD陽(yáng)性者為細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞群。(37-AAD陰性細(xì)胞群陰性細(xì)胞群計(jì)數(shù)為75%時(shí)為最低細(xì)胞活力。(4對(duì)于細(xì)胞活力低于75%的標(biāo)本,建議采用7-AAD結(jié)合CD45的方案,包括的組合方案。三、數(shù)據(jù)采集和分析(一聯(lián)合CD45和SSC設(shè)門確定淋巴細(xì)胞群方案1和方案2都存在CD45,首先建議采用聯(lián)合CD45和側(cè)向散射光SSC設(shè)門來(lái)確定淋巴細(xì)胞群。它是準(zhǔn)確分析淋巴細(xì)胞亞群的第一步,可以用于來(lái)定位淋巴細(xì)胞群

4、,把淋巴細(xì)胞群找到,排除標(biāo)本中非淋巴細(xì)胞或細(xì)胞碎片的干擾。首先在CD45/SSC散點(diǎn)圖中,調(diào)整SSC,使所有白細(xì)胞群均可見(jiàn)。第二步是根據(jù)CD45強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞群設(shè)門或者劃定區(qū)域。因?yàn)樵贑D45染色細(xì)胞中,淋巴細(xì)胞群呈現(xiàn)CD45強(qiáng)陽(yáng)性和SSC弱表達(dá)。設(shè)門時(shí)盡可能包括所有淋巴細(xì)胞,儀器會(huì)給一個(gè)提示,一共是包括了多少淋巴細(xì)胞數(shù)。一般門內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)不低于95%,而且要排除單核細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的感染,因?yàn)閱魏撕褪葔A在周圍,很容易對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行干擾。單核細(xì)胞的CD45呈弱表達(dá),而SSC呈中等強(qiáng)度表達(dá)。嗜堿性粒細(xì)胞的CD45和SSC均為低表達(dá)。如果不能確定標(biāo)記的淋巴細(xì)胞群是否被設(shè)門設(shè)的比較準(zhǔn)確,里面是否含有其他細(xì)

5、胞的干擾,還有一個(gè)辦法就是將CD3/SSC、CD19/SSC以及 CD56或CD(16+56/SSC中T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的分布特征篩選出來(lái),并在CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖中顯示,以監(jiān)測(cè)設(shè)門的準(zhǔn)確性。當(dāng)設(shè)門準(zhǔn)確了,準(zhǔn)確的找到淋巴細(xì)胞后,才能采集細(xì)胞數(shù)。第三步,采集細(xì)胞數(shù)。非設(shè)門熒光散點(diǎn)圖中,每一熒光通道至少收集5000個(gè)淋巴細(xì)胞,以確保對(duì)數(shù)量較少的淋巴細(xì)胞亞群(如占總淋巴細(xì)胞數(shù)的10%提供足夠量的細(xì)胞。 從上面的圖片上可以看到,圖形中畫黑框、標(biāo)記是紫色的細(xì)胞是淋巴細(xì)胞群,在它的上方是單核細(xì)胞,用紅顏色標(biāo)記,嗜堿性細(xì)胞CD45和SSC的表達(dá)較低,用粉顏色標(biāo)記的。(二淋巴細(xì)胞亞群分析和相對(duì)計(jì)

6、數(shù)首先在亞群分析時(shí)設(shè)置幾個(gè)散點(diǎn)圖:CD3/CD4散點(diǎn)圖、CD3/CD8散點(diǎn)圖、CD3/CD19散點(diǎn)圖、CD3/CD56或CD(16+56散點(diǎn)圖。散點(diǎn)圖設(shè)置完后,在每一個(gè)熒光散點(diǎn)圖中再設(shè)一個(gè)四象限門,將CD45/SSC散點(diǎn)圖中選定的淋巴細(xì)胞群中的表達(dá)該抗原的陰性細(xì)胞群和陽(yáng)性細(xì)胞群區(qū)分開(kāi)來(lái)。 第三步,進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)。T4細(xì)胞的計(jì)數(shù),一般先得到一 個(gè)相對(duì)計(jì)數(shù),也稱為百分比,比如CD3/CD4散點(diǎn)圖中CD3+CD4+細(xì)胞群占CD45/SSC散點(diǎn)圖中選定淋巴細(xì)胞群的百分比,這叫做T4細(xì)胞的相對(duì)計(jì)數(shù)百分率。它占的是前一個(gè)散點(diǎn)圖,在第一次設(shè)門的散定圖中淋巴細(xì)胞的百分率。T8細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)是CD3/CD8

7、散點(diǎn)圖中CD3+CD8+細(xì)胞群占CD45/SSC散點(diǎn)圖中選定淋巴細(xì)胞群的百分比。B淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是CD3/CD19散點(diǎn)圖中CD3-CD19+細(xì)胞群占CD45/SSC散點(diǎn)圖中選定淋巴細(xì)胞群的百分比。NK細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)是為CD3/CD56或CD(16+56散點(diǎn)圖中CD3-CD56+細(xì)胞群或CD3-CD(16+56 +占CD45/SSC散點(diǎn)圖中選定淋巴細(xì)胞群的百分比。T3細(xì)胞的百分率在四個(gè)散點(diǎn)圖中都可以計(jì)數(shù),因?yàn)槊恳粋€(gè)散點(diǎn)圖中都含有CD3的標(biāo)記。在CD3/CD4散點(diǎn)圖中,計(jì)數(shù)為CD3+CD4-單陽(yáng)性細(xì)胞群百分比和CD3+CD4+雙陽(yáng)性細(xì)胞群百分比的總和。在CD3/CD8散點(diǎn)圖中也一樣,計(jì)數(shù)為CD3+CD

8、8-單陽(yáng)性細(xì)胞群百分比和CD3+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞群百分比的總和。在CD3/CD19散點(diǎn)圖中,計(jì)數(shù)為CD3+CD19-細(xì)胞群百分比。在CD3/CD56或CD3/CD(16+56散點(diǎn)圖中,計(jì)數(shù)為CD3+CD56-或CD3-CD(16+56-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD(16+56+百分比的總和。(三淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)根據(jù)淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果,對(duì)于絕對(duì)計(jì)數(shù)來(lái)講,通常有兩種絕對(duì)計(jì)數(shù)的方法,一個(gè)是單平臺(tái)法,一個(gè)是雙平臺(tái)法。單平臺(tái)方法是采用了一個(gè)內(nèi)部的計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)的微球。所有的數(shù)據(jù)都可以從流式細(xì)胞儀這一臺(tái)儀器檢測(cè)到,由專用軟件直接計(jì)算生成,具體操作可以試劑操作說(shuō)明書。雙平臺(tái)方法,白細(xì)胞

9、計(jì)數(shù)需要與亞群分析使用同一標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試,并在6個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。當(dāng)白細(xì)胞計(jì)數(shù)不能準(zhǔn)確獲得時(shí),不能用DP方法進(jìn)行淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù),只能采用SP方法。不能采用淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)。因?yàn)榱馨图?xì)胞計(jì)數(shù)在血細(xì)胞分析儀上表現(xiàn)出更大變異度,白細(xì)胞計(jì)數(shù)作為分母比淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)更為穩(wěn)定。(四數(shù)據(jù)分析可靠性的驗(yàn)證1. CD45在有些驗(yàn)證中要采用CD45,CD45在三色和四色抗體組合方案的每一標(biāo)本管中均存在,這樣它既可以對(duì)淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門,因?yàn)樗诿恳还苤卸即嬖?也可以根據(jù)CD45表達(dá)情況和圖形分布情況檢測(cè)和評(píng)估樣本管間的變異,所以這是一個(gè)很好的一個(gè)驗(yàn)證方法。重復(fù)結(jié)果間的差異如果大于( 說(shuō)明樣本管間的

10、變異較大四、對(duì)照對(duì)于淋巴細(xì)胞亞群來(lái)講，同型對(duì)照是不需要的，因?yàn)镃D3、CD4和CD8的陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群都是 獨(dú)立成群，很容易區(qū)分，所以同型對(duì)照的意義不大。 （二）陽(yáng)性對(duì)照 需要陽(yáng)性對(duì)照，分為針對(duì)方法學(xué)的陽(yáng)性對(duì)照，以及針對(duì)試劑的陽(yáng)性對(duì)照。 1.針對(duì)方法學(xué)的陽(yáng)性對(duì)照 （1）目的 主要是監(jiān)測(cè)流式細(xì)胞儀上機(jī)分析前的環(huán)節(jié)是否出現(xiàn)問(wèn)題，包括裂解是不是完全、是不是染色效果很 差。當(dāng)由于紅細(xì)胞裂解不完全或染色較差時(shí)，包括陽(yáng)性對(duì)照在內(nèi)的所有的標(biāo)本結(jié)果都會(huì)出現(xiàn)偏差，所以這 時(shí)陽(yáng)性對(duì)照如果不好，就提示上機(jī)前的染色環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題。 （2）種類 陽(yáng)性對(duì)照可以用全血標(biāo)本來(lái)做，也可以用商品化熒光微球試劑。 （3）使用頻

11、率 每次上機(jī)前都需要做陽(yáng)性對(duì)照。 2.評(píng)價(jià)試劑的陽(yáng)性對(duì)照 （1） 目的 檢測(cè)新批號(hào)試劑和當(dāng)前批號(hào)試劑的染色效率是否出現(xiàn)問(wèn)題，當(dāng)懷疑試劑出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，采用該試劑與已 知可接受性能批號(hào)的試劑同時(shí)操作進(jìn)行驗(yàn)證。 （2）種類 陽(yáng)性對(duì)照可以是全血標(biāo)本，也可以是凍干淋巴細(xì)胞。 （3）使用頻率 一般是在更換試劑前后來(lái)做。 所謂“補(bǔ)償”就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號(hào)， 那么為什么需要進(jìn)行調(diào)整熒光補(bǔ)償？ 五、調(diào)整熒光補(bǔ)償 （一）目的 對(duì)于淋巴細(xì)胞亞群分析至少要采用雙色方案，最好采用四色方案，所以熒光補(bǔ)償是非常重要的，表達(dá) 一個(gè)檢測(cè)結(jié)果是否有準(zhǔn)確，完全受到的干擾是熒光補(bǔ)償，是一個(gè)重要的因素。當(dāng)光

12、學(xué)檢測(cè)通道的電壓及增 益發(fā)生變動(dòng)，當(dāng)儀器維修保養(yǎng)后，都要對(duì)補(bǔ)償進(jìn)行驗(yàn)證或重新調(diào)整。 （二）方法 6 調(diào)整的方式有手工的方式，還有軟件自動(dòng)補(bǔ)償方式。 （三）補(bǔ)償試劑的選擇 1.一般選擇與最強(qiáng)熒光信號(hào)相匹配的補(bǔ)償試劑。 2. 三色抗體組合分析 三色抗體組合分析時(shí)要通過(guò)含有熒光微球或細(xì)胞補(bǔ)償顆粒的4個(gè)單標(biāo)記樣本管來(lái)調(diào)整補(bǔ)償。第一管是 無(wú)直標(biāo)抗體標(biāo)本管，只有標(biāo)本沒(méi)有抗體。第二管是僅含有FITC直標(biāo)抗體的陽(yáng)性標(biāo)本管。第三管是僅含PE直 標(biāo)抗體的陽(yáng)性標(biāo)本管。第四管是僅含第三種直標(biāo)抗體的陽(yáng)性標(biāo)本管。 3.四色抗體組合分析 可以在三色抗體組合的基礎(chǔ)上再加上一管，也就是第五個(gè)管子，第五管是僅含有第四種直標(biāo)抗體陽(yáng)

13、性 標(biāo)本管。 （四）熒光補(bǔ)償順序 1.三色組合方案 依次是FITC、PE和第三種熒光。先做FITC，然后PE，再做第三種熒光。補(bǔ)償達(dá)到一個(gè)理想狀態(tài)是將不 應(yīng)該是兩種熒光抗體雙陽(yáng)性的細(xì)胞群調(diào)整到相應(yīng)的直角熒光象限中，使雙陽(yáng)象限中無(wú)熒光重疊。要避免過(guò) 度補(bǔ)償，以防將雙陽(yáng)性細(xì)胞錯(cuò)誤地識(shí)別為單陽(yáng)性細(xì)胞。 2.四色組合方案 一般試劑說(shuō)明書有一個(gè)很好的說(shuō)明，可以按照說(shuō)明書進(jìn)行執(zhí)行，要注意避免過(guò)度補(bǔ)償。 六、結(jié)果報(bào)告和審核 （一）臨床報(bào)告的內(nèi)容 對(duì)于淋巴細(xì)胞亞群所出的臨床報(bào)告，一般有以下幾個(gè)內(nèi)容：T3細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比/絕對(duì)計(jì)數(shù)(絕對(duì) 值、T4細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比/絕對(duì)計(jì)數(shù)(絕對(duì)值、T8細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)(百分

14、比/絕對(duì)計(jì)數(shù)(絕對(duì)值、B細(xì)胞 相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比/絕對(duì)計(jì)數(shù)(絕對(duì)值、NK細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)(百分比/絕對(duì)計(jì)數(shù)(絕對(duì)值 、T4/T8比值、參考 范圍、必要的解釋和分析。 （二）審核內(nèi)容 審核的內(nèi)容包括有數(shù)據(jù)采集閾值的設(shè)定、采集細(xì)胞數(shù)和微粒數(shù)、散射光模式、抗體組合方案，與試劑 結(jié)果相關(guān)的所有設(shè)門。在發(fā)出報(bào)告之前，要把這些方面的內(nèi)容都進(jìn)行一個(gè)審核，審核確認(rèn)無(wú)誤后才能將結(jié) 果發(fā)放給臨床。 七、儲(chǔ)存 （一）采用列表模式儲(chǔ)存標(biāo)本數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)在儲(chǔ)存方面也有一定的要求，要把所有的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行儲(chǔ)存，所以一般采用的是列表模式，儲(chǔ)存 標(biāo)本數(shù)據(jù)，以確保對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析。 7 （二）采用紙質(zhì)文件或電子版 儲(chǔ)存的內(nèi)容包括：每

15、個(gè)樣本CD45和SSC淋巴細(xì)胞群設(shè)門圖，顯示淋巴細(xì)胞亞群的所有的熒光散點(diǎn)圖的 分析結(jié)果，針對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的室內(nèi)質(zhì)控圖以及室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)，評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)性能的所有參數(shù)，包括分析 區(qū)域、分析結(jié)果，以備進(jìn)行一個(gè)復(fù)核。 （三）儲(chǔ)存期限 一般建議保留兩年所有的數(shù)據(jù)。 八、質(zhì)量控制 （一）室內(nèi)質(zhì)量控制 要求每月進(jìn)行室內(nèi)控制檢測(cè)，對(duì)于特殊實(shí)驗(yàn)如艾滋病T4細(xì)胞計(jì)數(shù)建議每周進(jìn)行一次。 （二）室間質(zhì)量評(píng)價(jià) 推薦使用衛(wèi)生部臨檢中心和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）的室進(jìn)質(zhì)評(píng)。 （三）人員培訓(xùn) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)由于技術(shù)要求含量較高，要完成流式細(xì)胞儀廠家的基本培訓(xùn)，同時(shí)也要完成專業(yè)操作 培訓(xùn)班的定期培訓(xùn)。 淋巴細(xì)胞亞群最常見(jiàn)的有5個(gè)項(xiàng)目，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì) 胞和CD8+T細(xì)胞。這5個(gè)項(xiàng)目具有明確的臨床意義，也是臨床應(yīng)用最廣的檢測(cè)項(xiàng) 目，非常適合檢