融合蛋白標(biāo)簽

1、在蛋白質(zhì)功能及結(jié)構(gòu)研究過(guò)程中，研究的首要任務(wù)就是利用多種方法獲得純 化的具有完整結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能并能夠正確折疊的高度純化蛋白質(zhì)。除了蛋白質(zhì)的研究，具有特定生物活性的高價(jià)值蛋白質(zhì)的生產(chǎn)也需要對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行純化。 因此，科研人員和工業(yè)生產(chǎn)往往大量采用多種多樣的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)獲得高表達(dá)的蛋 白質(zhì)，對(duì)其純化后進(jìn)行研究或加工，這些表達(dá)系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)、 酵母菌表 達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。如何將系統(tǒng)中表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他蛋白別離，一直是表達(dá)純化中的一個(gè)重點(diǎn)。為了克服從復(fù)雜樣品中純化單一蛋白質(zhì)這種困難，科學(xué)家利用生物物質(zhì)， 特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識(shí)別某種特定物質(zhì)并與該物質(zhì)

2、分子特異性結(jié)合的 能力，利用生物分子間的這種特異性結(jié)合能力而形成的親和純化技術(shù)。親和標(biāo)簽純化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白的別離純化中。在重組蛋白的親 和純化中，利用基因工程技術(shù)，將經(jīng)過(guò)改造優(yōu)化的親和標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)， 通過(guò)一步簡(jiǎn)單快速的親和層析，直接獲得純度較高的重組融合蛋白，已成為重組 蛋白純化的一個(gè)通用方法，具有結(jié)合特異性高、純化步驟簡(jiǎn)便、純化條件溫和、 適用性廣泛等優(yōu)點(diǎn)，為蛋白質(zhì)的有效純化提供了一條解決的途徑，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究及重組蛋白純化工藝的開(kāi)發(fā)中。自從20世紀(jì)70年代中期融合標(biāo)簽技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，親和標(biāo)簽已成為一種重組蛋白純化十分有效的工具，具有結(jié)合特異

3、性高、純化條件溫和、純化步驟簡(jiǎn)便、 適用性廣泛等顯著優(yōu)勢(shì)。通常，親和標(biāo)簽定義為對(duì)特定的生物或化學(xué)配基具有高 度親和力的一段氨基酸序列。到目前為止，已經(jīng)出現(xiàn)了種類眾多、功能各異、用 途多樣的親和標(biāo)簽，極大地促進(jìn)了對(duì)重組蛋白的有效純化。根據(jù)自身分子量大小的不同，親和標(biāo)簽可以分為兩大類：一類是結(jié)合固定化 配基的短肽標(biāo)簽，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tag U等；另一類是識(shí)別小分子 配基的蛋白標(biāo)簽，如GST MBP等。短肽標(biāo)簽： His-tag : His標(biāo)簽是目前高通量蛋白純化最普遍使用的親和標(biāo)簽，廣泛用于多 種重組蛋白在各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)與純化中。His標(biāo)簽一般為515個(gè)組氨酸

4、，被認(rèn)為是重組蛋白純化的首選標(biāo)簽，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1位于目標(biāo)蛋白N端的 His標(biāo)簽與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制相互兼容，利于蛋白的表達(dá)；2His標(biāo)簽幾乎不影響目標(biāo)蛋白的理化性質(zhì)；3His標(biāo)簽很小，不會(huì)改變目標(biāo)蛋白的可溶性； 4His標(biāo)簽在目標(biāo)蛋白結(jié)晶后對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有影響；5采用固定化金 屬離子親和層析純化His標(biāo)簽融合蛋白時(shí)，其操作非常簡(jiǎn)便。基于上述優(yōu)點(diǎn)，幾 乎所有的大型結(jié)構(gòu)基因組研究中心都把純化His標(biāo)簽融合蛋白的固定化金屬離子親和層析immobilized metal-ion affinity chromatography， IMAC 作為主要的蛋白純化方法。然而，并不是所有的蛋白質(zhì)都可以與 H

5、is標(biāo)簽融合后，采用固定化金屬離子 親和層析別離純化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然發(fā)生的組氨酸豐富區(qū)域，在固定化金屬離子親和層析時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致其他蛋白的非特異性結(jié)合； 目標(biāo)蛋白含有 金屬離子，一般也不米用His標(biāo)簽與固定化金屬離子親和層析。FLAG-tag：除了 His標(biāo)簽外，另一個(gè)廣泛使用的小分子短肽標(biāo)簽是FLAG標(biāo)簽。FLAGB簽是由8個(gè)氨基酸DYKDDDD組成的一個(gè)短肽，分子量很小，因而不會(huì) 遮蓋融合蛋白中其他的蛋白表位與結(jié)構(gòu)域，也不會(huì)改變?nèi)诤系鞍椎墓δ?、分泌或運(yùn)輸。該標(biāo)簽具有天然的親水特性，很容易定位于融合蛋白的外表，便于利用抗 體檢測(cè)；同時(shí)含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn)DDDK，可以利用腸激酶

6、切除標(biāo)簽。FLAG 標(biāo)簽有3個(gè)特異性的單克隆抗體，分別為 M1單抗、M2單抗、M5單抗。FLAG短 肽合成本錢(qián)較高，不適用于大規(guī)模純化，且需要額外步驟除去結(jié)合在層析介質(zhì)上 的短肽。Strep-tag n：與 His-tag、FLAG-tag 相似，Strep-tag U 也是一個(gè)小分子的短 肽標(biāo)簽，廣泛用于多種目標(biāo)蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等的表 達(dá)與純化中。在自然界中，鏈霉親和素streptavidin丨與生物素biot in丨之 間存在著非常強(qiáng)烈的非共價(jià)相互作用，其生物學(xué)上的解離常數(shù)極低；即使生物素與其他蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合之后，兩者仍可以相互作用。基于這兩者之間的強(qiáng)烈相互 作用，

7、運(yùn)用一系列蛋白質(zhì)工程手段，通過(guò)對(duì)短肽文庫(kù)的篩選，第一個(gè)鏈霉親和素 結(jié)合肽應(yīng)運(yùn)而生，即 Strep-tag，極大地方便了重組蛋白的一步快速親和純化。 然而，Strep-tag與鏈霉親和素結(jié)合時(shí)需要一個(gè)自由的羧基末端，因而該標(biāo)簽只 能位于目標(biāo)蛋白的C端，限制了它的應(yīng)用范圍。在Strep-tag的根底上，通過(guò)對(duì) 合成短肽的篩選，獲得了一個(gè)與其相似、由8個(gè)氨基酸 WSHPQFEK&成的鏈霉 親和素結(jié)合肽，即 Strep-tag n，可以位于融合蛋白的任意位置，從而彌補(bǔ)了Strep-tag的缺乏。同時(shí)，通過(guò)對(duì)鏈霉親和素特定氨基酸的定向突變，獲得了與 Strep-tag U具有更高親和力的親和介質(zhì)

8、 Strep-tact in ，在Strep-tag U融合蛋 白的親和純化中表現(xiàn)出良好的純化效果，且蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高，所需本錢(qián)適中。Strep-tag U系統(tǒng)的純化條件比擬寬泛，在普通緩沖液下就可與strep-Tactin n 融合蛋白洗脫下來(lái)，螯合劑、去污劑、復(fù)原劑 及高達(dá)1mol/L的鹽均可參加到緩 沖液中。此外，Strep-tag n在純化過(guò)程中不依賴金屬離子， 十分適合含金屬離 子蛋白質(zhì)的純化。蛋白標(biāo)簽：GST GST標(biāo)簽由211個(gè)氨基酸組成，大小約為26kDa,是目前廣泛用于重組蛋白 融合表達(dá)與親和純化的一種蛋白標(biāo)簽。大量的表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中過(guò)量表達(dá)時(shí)，常會(huì)以

9、包涵體的形式形成不溶性的聚合體，大大降低 了可溶性重組蛋白的產(chǎn)量，增加了后續(xù)蛋白別離純化的難度。然而，在融合GST標(biāo)簽進(jìn)行原核表達(dá)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，原本用于親和純化的GST標(biāo)簽?zāi)茉谝欢ǔ潭壬显龃笕诤系鞍椎目扇苄裕谷诤系鞍滓钥扇苄问酱嬖谟诩?xì)胞質(zhì)中，不僅促進(jìn)了目標(biāo)蛋白的正確折疊，提高了蛋白產(chǎn)量，而且有助于后續(xù)的蛋白純化。除了增大 融合蛋白的可溶性之外，GST標(biāo)簽還具有高效的翻譯起始、純化條件溫和、親和 樹(shù)脂本錢(qián)相對(duì)低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)，成為重組蛋白融合表達(dá)經(jīng)常使用的親和標(biāo)簽。MBP MBP標(biāo)簽由大腸桿菌K12的malE基因編碼的396個(gè)氨基酸組成，大小約為 40kDa,是除了 GST標(biāo)簽之外又一個(gè)很好的增

10、大融合蛋白可溶性的蛋白標(biāo)簽。MBP標(biāo)簽?zāi)軌蛟龃笤谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的可溶性，提高其表達(dá)量，已在多個(gè)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中得到確認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)改變MBP “開(kāi)放與“關(guān)閉構(gòu)象之間的平衡時(shí)，MBP增大融合蛋白可溶性的能力將受到明顯影響，說(shuō)明MBP增大 融合蛋白可溶性的特性是由其“開(kāi)放構(gòu)象所介導(dǎo)；同時(shí)，對(duì)MBP配基結(jié)合間隙中保守的疏水性氨基酸殘基進(jìn)行定向突變，MBPS現(xiàn)出相似的表型，說(shuō)明這個(gè)配基結(jié)合間隙在MBP增大融合蛋白可溶性的機(jī)制中具有一定的作用。然而，從蛋白純化的角度來(lái)看，MBPg簽并不是一個(gè)最有效的親和標(biāo)簽；在某些 情況下，MBP標(biāo)簽并不能特異性地與親和樹(shù)脂有效結(jié)合，親和層析后融合蛋白的

11、純度也并不適宜。自從上世紀(jì)70年代中期親和標(biāo)簽融合技術(shù)出現(xiàn)以來(lái)，多種多樣的短肽或蛋白親和標(biāo)簽極大地方便了外源表達(dá)重組蛋白的別離與蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化，已成為蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域不可或缺的工具。 一般而言，一個(gè)完美的親和標(biāo)簽應(yīng)該具備以 下特性：1能夠用于純 化任何表達(dá)宿主或表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白；2可以位于目標(biāo)蛋白的任意位置而不影響其結(jié)構(gòu)；3增大目標(biāo)蛋白的可溶性， 促進(jìn)其正確折疊，提高蛋白表達(dá)量；4便于重組蛋白的檢測(cè)。目前，商品化 的親和標(biāo)簽已具備其中諸多特性，但性能更加優(yōu)越、純化效果更加顯著的親和 標(biāo)簽仍需不斷尋找與開(kāi)發(fā)。重組蛋白表達(dá)技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)具體領(lǐng)域。 特別是體內(nèi)功能 研究和蛋

12、白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用重組蛋白表達(dá)載體。美國(guó)GeneCopoeia的蛋白表達(dá)載體按照表達(dá)宿主的不同新推出 3類，分別為 表達(dá)宿主為大腸桿菌， 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的， 以及慢病毒載體， 宿主可以為哺乳動(dòng)物 細(xì)胞和原代細(xì)胞。除了必要的復(fù)制和篩選的元件， 協(xié)助表達(dá)和翻譯的元件外， 本文將各類載體 分別按照功能標(biāo)簽的不同確定種類并將個(gè)標(biāo)簽的功能初步介紹如下：His6：His6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一個(gè)標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測(cè)；二是構(gòu)成獨(dú)特 的結(jié)構(gòu)特征結(jié)合配體利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力， 可用于固定化金屬螯合層析IMA

13、C，對(duì)重組蛋白進(jìn)行別離純化。使用 His-tag 有下面優(yōu)點(diǎn)：1. 標(biāo)簽的分子量小，只有0.84KD,而GST和蛋白A分別為26KD和30KD 一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；外表活性劑存在的條件下或變性條件下純化， 前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得 到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用， 用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬 螯和親和層析去除雜蛋白， 使復(fù)性不受其它蛋白的干擾， 或進(jìn)行金屬螯和親和層 析復(fù)性；3. His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；4. His 標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低， 可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫制備 抗體；5. 可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和

14、；6. 可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。Flag:Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽DYKDDDD，同時(shí)載體中構(gòu) 建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：1. FLAG 作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究2. 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變 性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高。3. FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便

15、通過(guò)Western Blot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。4融合在N端的FLAG其可以被腸激酶切除DDD從而得到特異的目的 蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其 蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。MBP:MBP麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽蛋白大小為 40kDa,由大腸桿菌K12的malE基 因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。 MBP標(biāo)簽可通過(guò)免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽。 如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。純化：融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白

16、可用 10m M麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍。一些融合蛋 白在 0.2% Triton X-100 或 0.25% Tween 20 存在下不能有效結(jié)合，而其他融合 蛋白那么不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達(dá)1M,但不能使用變 性劑。如果要去除MBF融合局部，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用MBPK體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。GST:GST谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作 用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為 26KD將它應(yīng)用在原核表達(dá)的原因大致有兩個(gè)， 一個(gè)是因?yàn)樗且粋€(gè)高度可溶的蛋白， 希 望可以利用它增加外源蛋白的可溶

17、性；另一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)， 起到提高表達(dá)量的作用。GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可 以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用 10mM復(fù)原型谷胱甘肽洗脫。在大多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的， 并形成二體。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測(cè)。標(biāo)簽有助于保護(hù) 重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或局部可溶的純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有復(fù)原 型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathionesepharose) 親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋 白可在溫

18、和、非變性條件下洗脫，因此保存了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力， 因此不能在純化緩沖液中參加強(qiáng) 變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合局部，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。HAHA標(biāo)簽蛋白，標(biāo)簽序列YPYDVPDYA源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素外表抗原 決定簇， 9 個(gè)氨基酸，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小 , 容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融 合到N端或者C端。易于用Anti HA抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。c-MycC-Myc標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含11個(gè)氨基酸的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列 Glu-Gl n-Lys- Leu-I

19、le-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu ，這11 個(gè)氨基酸作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白 質(zhì)框架中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。 C-Myc tag 已成功應(yīng)用在 Western-blot 雜交技 術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中 , 可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分別是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 / 增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白 / 增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋 白/單體紅色熒光蛋白 ,具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)為， 均由野生型熒光蛋白通 過(guò)氨基酸突變和密碼子優(yōu)化而來(lái)。就eGFP而言，相對(duì)于GFP其熒光強(qiáng)度更強(qiáng)、熒光性質(zhì)更穩(wěn)定。同時(shí)載體中構(gòu)建的 Kozak序列使得含有eGF

20、P的融合蛋白在真 核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。mCherry是從DsRed演化來(lái)的性能最好的一個(gè)單體 紅色熒光蛋白，可以和GFP系列熒光蛋白共用，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明， mCherry在N端和C端融合外源蛋白時(shí)，熒光蛋白活性和被融合的目標(biāo)蛋白功能 相互沒(méi)有明顯影響。 這些熒光標(biāo)簽蛋白， 其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：1. 不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物， 直接通過(guò)熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中 發(fā)出綠色熒光， 實(shí)時(shí)顯示目的基因的表達(dá)情況， 而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定， 被譽(yù)為活細(xì) 胞探針。2. 其自發(fā)熒光，不需用目的基因的抗體或原位雜交技術(shù)就可推知目的基因在 細(xì)胞中的定位等情況。3. 同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的其

21、它產(chǎn)物不會(huì)干擾標(biāo)簽蛋白檢測(cè)， 從而使其檢測(cè)更顯得快速、 簡(jiǎn)便、靈敏度高而且重現(xiàn)性。4. 其低消耗、高靈敏度檢測(cè)，十分適用于高通量的藥物篩選。因此現(xiàn) eGFP 表達(dá)標(biāo)簽被廣泛地應(yīng)用于基團(tuán)表達(dá)調(diào)控、 轉(zhuǎn)基因功能研究、 蛋白在細(xì)胞中的功能 定位、遷移變化及藥物篩選等方面。5. mCherry 紅色熒光蛋白在標(biāo)記病毒顆粒， 研究病毒和宿主細(xì)胞之間更有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。如用 mRFP或mCherry標(biāo)記HIV病毒顆粒，研究H1V和宿主細(xì)胞 問(wèn)的相互作用以及HIV侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程用 mRFP標(biāo)記慢病毒顆粒，研究慢 病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程等。熒光素酶 來(lái)源于生物體內(nèi)的熒光素，常見(jiàn)的有螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎熒

22、光素酶和Guassia 熒光素酶。這些熒光素酶作為“報(bào)告蛋白被用于分子生物學(xué)研究中， 這種技術(shù)被稱為報(bào)告基因檢測(cè)法或螢光素酶檢測(cè)法 Luciferase Assay 。跟普 通融合蛋白標(biāo)簽不同， 使用熒光素酶構(gòu)建的報(bào)告基因可用作目的基因的定量分析。 因此常用于研究啟動(dòng)子、miRNA3'UTR克隆的功能與調(diào)控，因?yàn)樗鼈儗?duì)目的基因 的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡(jiǎn)單的開(kāi)和關(guān)兩種狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，檢測(cè)幅度寬；不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性基因；重復(fù)性好；與HTS兼容等。螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于協(xié)同報(bào)告并進(jìn)行均一化 研究。由于它們都是快速， 容易和高靈敏的監(jiān)測(cè)方法。 而且螢火蟲(chóng)和海腎熒光素

23、 酶是理想的雙基因報(bào)告系統(tǒng)， 因?yàn)樗鼈儊?lái)源于不同的生物進(jìn)化方向， 蛋白結(jié) 構(gòu)和底物差異都很大，在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)產(chǎn)生相互影響。基于熒光素酶的特性，我司研發(fā)提供的 Secrete-Pair? Dual LuminescenceAssay Kit可用于分析雙報(bào)告系統(tǒng)中 Gaussia熒光素酶GLuc和分泌型堿性磷 酸酶(SEAP)活性。GLuc和SEAP勻?yàn)榉置谛蛨?bào)告蛋白，無(wú)需裂解細(xì)胞即可便捷的 從細(xì)胞培養(yǎng)液中取得樣本，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行精準(zhǔn)的實(shí)時(shí)分析。Avi TagAviTag 標(biāo)簽蛋白是一個(gè) 15 個(gè)氨基酸的短肽， 具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C

24、端。融合表達(dá)后， 可被生物素連接酶生物素化， 為了純化重組蛋白選用低親和性的單體 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物， 除了用于蛋白質(zhì)別離純化， 還用于蛋白質(zhì) 相互作用研究。Avi Tag 標(biāo)簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點(diǎn) :1. 無(wú)論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)獨(dú)特的 Avi Tag位點(diǎn) 輕易且有效地被生物素化；2. 生物素化是通過(guò)酶和底物的反響來(lái)實(shí)現(xiàn)， 反響條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專 一性極高；AviTag 只有 1 5個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小。SNAP-TagSNAP-Tag是新一代的蛋白標(biāo)簽技術(shù)，不僅專一性極高而且穩(wěn)定，最大的優(yōu) 點(diǎn)是適用于多種環(huán)境下的蛋白質(zhì)檢測(cè)與純化，

25、如活細(xì)胞內(nèi)、溶液中、或固態(tài)相 (如 SDS-PAGE gels)等。SNAP-Tag是從人的 06-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移06-alkylguanine-DNA- alkyltransferase獲得。無(wú)論體內(nèi)還是體外，SNAP-Tag都能與底物高特異性地共價(jià)結(jié)合，使蛋白標(biāo)記上生物素或熒光基團(tuán)如熒光素和假設(shè)丹明。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥(niǎo)嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)， 釋放出了鳥(niǎo)嘌呤。 這種新的硫醚鍵共價(jià)結(jié)合使 SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo) 記物。苯甲基鳥(niǎo)嘌呤在生化條件下穩(wěn)定，并且沒(méi)有其他蛋白會(huì)和這類物質(zhì)作用， 所以SNAPB簽反響是高特異的。檢測(cè)：生物素或各種顏色熒光的底物如熒光素、假設(shè)丹明可滲透進(jìn)入細(xì) 胞，方便快捷地進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi) SNAP-Tag融合蛋