凍干乙型腦炎滅活疫苗(Vero細(xì)胞)

1、凍干乙型腦炎滅活疫苗（Vero細(xì)胞）Donggan Yixing Naoyan Miehuoyimiao (Vero Xibao) Japanese Encephalitis Vaccine（Vero Cell），Inactivated, Freeze-dried 本品系用乙型腦炎(以下簡稱乙腦)病毒接種于Vero細(xì)胞, 經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒、濃縮、純化后，加入穩(wěn)定劑凍干制成，用于預(yù)防乙腦。1. 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合 “凡例”有關(guān)要求。 2. 制造 2.1 生產(chǎn)用細(xì)胞 生產(chǎn)用細(xì)胞為Vero細(xì)胞。 細(xì)胞庫的管理及檢定應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)和檢定用

2、動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。各種子批代次應(yīng)不超過批準(zhǔn)的限定代次，取自同批工作細(xì)胞庫的1支或多支細(xì)胞管，經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后的細(xì)胞僅用于一批疫苗的生產(chǎn)。 細(xì)胞制備取工作細(xì)胞庫中的1支或多支細(xì)胞管，細(xì)胞復(fù)蘇、 擴(kuò)增至接種病毒的細(xì)胞為1批。將復(fù)蘇后的單層細(xì)胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進(jìn)行消化， 分散成均勻的細(xì)胞， 加入適宜的培養(yǎng)液混合均勻，置3537培養(yǎng)形成致密單層細(xì)胞。2.2 毒種名稱及來源生產(chǎn)用毒種為乙腦病毒P3株。種子批的建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。乙腦病毒P3株原始種子應(yīng)不超過第53代， 主種子批和工作種子批的代次應(yīng)不超過批準(zhǔn)的限定代次。種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)

3、進(jìn)行如下全面檢定，工作種子批至少應(yīng)進(jìn)行5項(xiàng)檢定。 .1鑒別試驗(yàn)將毒種10倍系列稀釋，取10-110-5稀釋度的病毒液與乙腦特異性免疫血清等量混合作為試驗(yàn)組，取10-410-8稀釋度的病毒液與乙型腦炎非特異性血清等量混合作為對照組，于37水浴中和90分鐘，試驗(yàn)組和對照組每個(gè)稀釋度分別接種體重為7-9g 昆明鼠或其他品系小鼠20只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，逐日觀察，3日內(nèi)死亡不計(jì)，觀察14天，計(jì)算中和指數(shù)應(yīng)不低于500。 .2無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。.3支原體檢查 依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。 .4 病毒滴定 將毒種10倍系列稀釋，取10-610-9稀釋度病

4、毒液腦內(nèi)接種體重為79g 昆明鼠或其他品系小鼠，每稀釋度注射小鼠4只，每只0.03ml，逐日觀察，3日內(nèi)死亡者不計(jì)，觀察14天，病毒滴度應(yīng)不低于8.0 Lg LD50/ml。.5 病毒外源因子檢查 依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。 .6免疫原性檢查用主種子批毒種制備原疫苗，腹腔免疫體重為1214g NIH小鼠10只，每只0.3ml，免疫2次，間隔7天，初免后第14天， 對免疫組和未經(jīng)免疫的對照組小鼠用不低于10 000 LD50病毒量的非生產(chǎn)用乙腦病毒P3株進(jìn)行腹腔攻擊，同時(shí)各組小鼠每只腦腔注射0.03ml稀釋液。21天后免疫組應(yīng)100%保護(hù)，對照組死亡率應(yīng)不低于80%。 毒種保存凍干

5、毒種保存于-20以下，液體毒種保存于- 60以下。2.3 原液 細(xì)胞制備 按項(xiàng)進(jìn)行。 培養(yǎng)液 培養(yǎng)液為含有適宜濃度滅能新生牛血清的199或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D），且乙腦抗體應(yīng)為陰性。 對照細(xì)胞病毒外源因子檢查 依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。 病毒接種和培養(yǎng) 細(xì)胞生長成致密單層時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用Earles液或其他適宜的洗滌液充分沖洗細(xì)胞,除去牛血清后,加入MEM維持液。工作種子批毒種按0.050.3MOI接種（同一批工作種子批應(yīng)按同一MOI接種）。 置適宜溫度下培養(yǎng)。 病毒收獲 經(jīng)培養(yǎng)60-84小時(shí)，澄清過濾后收獲病毒液。根據(jù)細(xì)胞生長情況，

6、可加入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)， 進(jìn)行多次病毒收獲。同一細(xì)胞批的同一次病毒收獲液檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。2.3.6 單次病毒收獲液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。 2.3.7 病毒滅活 應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活。單次病毒收獲液中加入終濃度為200ug/ml甲醛，置適宜溫度滅活一定時(shí)間。病毒滅活到期后，每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣， 分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。2.3.8 超濾濃縮 同一細(xì)胞批制備的多個(gè)單次病毒收獲液經(jīng)病毒滅活后， 進(jìn)行適宜倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。 2.3.9 純化 濃縮后的病毒液采用蔗糖密度梯度區(qū)帶離心法或其他適宜的方法進(jìn)行純化。2.3.10脫糖將收集液以截留分

7、子量100kD的膜進(jìn)行超濾脫糖后，可加入適宜濃度的穩(wěn)定劑，即為原液。 2.3.11 原液檢定 按3.2 項(xiàng)進(jìn)行。 2.4半成品 配制用疫苗稀釋液將原液按同一蛋白質(zhì)含量和抗原含量進(jìn)行稀釋，總蛋白質(zhì)含量不得超過20ug/ml，加入適宜的穩(wěn)定劑即為半成品。 半成品檢定按3.3項(xiàng)進(jìn)行。2.5成品 分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。 分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。 規(guī)格 復(fù)溶后每瓶0.5ml，每1次人用劑量0.5ml。 包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。 3檢定 3.1 單次病毒收獲液檢定 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。支原體檢查 依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符

8、合規(guī)定。病毒滴定按.4項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)不低于7.0 Lg LD50/ml。3.2 原液檢定無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。3.2.2 病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn) 將病毒滅活后供試品腦內(nèi)接種體重1214g小鼠8只，每只0.03ml，同時(shí)腹腔接種0.5 ml， 為第1代； 7天后將第1代小鼠處死3只，取腦制成10%腦懸液，同法腦內(nèi)接種1214g小鼠6只，為第2代；7天后將第2代小鼠處死3只，同法腦內(nèi)接種1214g小鼠6只為第3代， 接種后逐日觀察，3日內(nèi)死亡者不計(jì)， 觀察14天，全部健存為合格。（動(dòng)物死亡數(shù)量應(yīng)不超過試驗(yàn)用動(dòng)物總數(shù)的20% ）。3.2.3 蛋白質(zhì)含量應(yīng)按附錄VI B第二法進(jìn)行測定

9、，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.2.4 抗原含量采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.3 半成品檢定 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。 抗原含量采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.4 成品檢定除水分測定外， 應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水， 復(fù)溶后進(jìn)行以下各項(xiàng)檢定。 鑒別試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫法檢測， 應(yīng)證明含有乙型腦炎病毒抗原。 外觀應(yīng)為白色疏松體，復(fù)溶后應(yīng)為無色澄明液體，無異物。 3.4.3水分 應(yīng)不高于3.0%（附錄 VII D）。 3.4.4 游離甲醛含量 應(yīng)不高于10g/ml（附錄VI L）。3.4.5 效價(jià)測定采用免疫小鼠中和抗體測定法， 以蝕斑減少中和試驗(yàn)測定中和抗體。

10、 參考疫苗（RA和RB）以及中和試驗(yàn)陽性血清由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)提供。將被檢疫苗(T)和參考疫苗(R)分別稀釋成1：32，腹腔免疫體重為1214g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，間隔7天。第2次免疫后第7天采血，分離血清，同組小鼠血清等量混合，于56滅活30分鐘。稀釋陽性血清、被檢苗血清和參考苗血清，分別與稀釋病毒(約200PFU/0.4ml)等量混合，同時(shí)將稀釋后的病毒再1：2稀釋作為病毒對照，置37水浴90分鐘，接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板BHK21細(xì)胞，每孔0.4 ml，置37培養(yǎng)90分鐘，加入含甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋物，于37培育5天，染色，蝕斑計(jì)數(shù)，病毒對照組的蝕斑平均數(shù)應(yīng)在50150之間

11、。計(jì)算被檢疫苗和參考疫苗組對病毒對照組的蝕斑減少率。 蝕斑減少率=（1S/ CV）100% S 為被檢苗平均斑數(shù) CV 為病毒對照組平均斑數(shù) 按以下公式計(jì)算被檢苗效力T 值。 T=（Y50）/ 47.762 Lg X T= 被檢苗引起50%蝕斑減少的抗體稀釋度的對數(shù) Y為被檢苗的蝕斑減少數(shù) X 為蝕斑中和試驗(yàn)時(shí)所用的血清稀釋倍數(shù) 結(jié)果判定： （1）合格： T （RA+RB）/ 2 0.33 （2）重試：（RA+RB）/2 0.66 T（RA+RB）/ 2 0.33 （3）不合格： T（RA+RB）/ 2 0.66 3.4.6 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)， 于37放置7天，按3.4.5項(xiàng)進(jìn)行效價(jià)測定，仍應(yīng)合格。如合格， 視為效價(jià)測定合格。 3.4.7牛血清白蛋白殘留量應(yīng)不高于50ng/劑（附錄VIII F）。無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。 3.4.9 異常毒性檢查依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。 細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定應(yīng)不高于50EU/ml（附錄XII E 凝膠限量試驗(yàn)） 抗生素殘留量測定細(xì)胞制備過程中加入抗生素的應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查， 采用ELISA法，應(yīng)不高于10ng/ml。 Vero細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于100pg/劑（附錄IX B）。