單細胞藻種質分離、培養(yǎng)和應用的

1、單細胞藻種質分離、培養(yǎng)和應用的技術操作規(guī)范中國科學院海洋研究所海洋生物種質庫聯(lián)系人：逄少軍一章 常見單細胞藻的生物學簡介第一節(jié) 綠藻一、 扁藻扁藻屬綠藻門，綠藻綱，團藻目，衣藻科，扁藻屬。常用種類有青島大扁藻和亞心形扁藻。形態(tài)特征：亞心形扁藻的藻體一般扁壓，細胞前面觀廣卵形，前端較寬闊，頂端前部凹陷。鞭毛4條由凹陷處生出。細胞內有一個大型、杯狀、綠色的色素體，后端有一個呈內上開口的杯狀蛋白核，有一個到數(shù)個紅色眼點比較穩(wěn)定地位于蛋白核附近、細胞中間略前。原生質體里有一個細胞核。細胞外有一層薄薄的纖維質細胞壁。細胞長1116微米，寬79微米，厚3.55微米。能快速活潑

2、游動。繁殖方式：無性繁殖，細胞縱分裂形成2個（少數(shù)情況下4個）子細胞，環(huán)境不良時形成休眠孢子。生態(tài)條件：1、鹽度 亞心形扁藻為廣鹽性，在880鹽度的水中均能生長繁殖。最適鹽度在3040之間。 2、溫度 亞心形扁藻為廣溫性，在730的范圍內均能生長繁殖，最適范圍在2028之間。3、光照 亞心形扁藻在光照強度為100020000勒克斯范圍內都能生長繁殖，最適光照強度約在500010000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。綠藻門的藻類在含有機質豐富的水中生長良好。二、 鹽藻鹽藻屬綠藻門，綠藻綱，團藻目，鹽藻科，鹽藻屬。主要培養(yǎng)種類是鹽藻，又

3、稱杜氏藻。形態(tài)特征：鹽藻沒有細胞壁，細胞外只有一層彈性膜，所以體形變化很大，有梨形、橢圓形、長頸形和紡錘形等。細胞內有一個杯狀的色素體，色素體內的色素主要是葉綠素，生活條件不良時產生血紅素，藻體呈紅色。在色素體內靠近基部有一個大的蛋白核，有一個紅色眼點位于細胞上部。原生質體中央有一個細胞核。前端生出兩條等長的鞭毛，鞭毛比細胞長約1/3。細胞長1624微米，寬1013微米。繁殖方式：無性繁殖，細胞縱分裂形成2個子細胞，環(huán)境不良時行有性生殖。生態(tài)條件：1、鹽度 鹽藻在高鹽度水中生長特別好。最適鹽度在6070之間。 2、溫度 鹽藻為廣溫性，可在440的范圍內存活，最適范圍在2535之間。3、光照 鹽

4、藻對光的適應性較強，最適光照強度約在20006000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH79的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.08.5之間。三、 小球藻小球藻屬綠藻門，綠藻綱，綠球藻目，卵孢藻科，小球藻屬。常見的有核蛋白小球藻、眼點小球藻、卵形小球藻、鹽生小球藻和海生小球藻等。形態(tài)特征：球形或廣橢圓形。細胞內具有杯狀（核蛋白小球藻）或呈邊緣生板狀（卵形小球藻）的色素體，核蛋白小球藻的色素體中有一個球形的蛋白核，細胞中央有一個細胞核。細胞大小依種類有所不同，核蛋白小球藻的細胞直徑35微米，在人工培養(yǎng)的情況下，生長良好時，細胞會變小。繁殖方式：以擬親孢子的方式行無性繁殖。首先在細胞內部進行原

5、生質體分裂，成為多個孢子，然后這些孢子破母細胞而出，每個孢子長成一個新個體。生態(tài)條件：小球藻的生態(tài)條件依種類而不同。1、鹽度 海水小球藻對鹽度的適應性很強，可以在河口、港灣、半咸水中生長繁殖。 2、溫度 一般的小球藻在1036的溫度范圍內都能比較迅速地繁殖，最適范圍在25左右。3、光照 最適光照強度約在10000勒克斯左右。4、酸堿度 最適范圍約在pH68之間。小球藻在有機質豐富（特別是氮肥）的水中生長特別繁茂。四、 微綠球藻微綠球藻（Nannochloropsis oculata）屬綠藻門，綠藻綱，四胞藻目，膠球藻科。形態(tài)特征：細胞球形，單獨或集合。色素體一個，淡綠色，側生。眼點淡橘紅色。在

6、生長良好的情況下，色素體很深，不容易觀察到眼點。沒有蛋白核。有淀粉粒13個，明顯，側生。細胞壁級薄，細胞分裂時細胞壁與細胞之間形成空隙。繁殖方式：進行二分裂繁殖，母細胞分裂成二個子細胞，子細胞由母細胞的細胞壁斷裂處脫出，子細胞附著在細胞壁上，成為一個松散的樹枝狀群體。生態(tài)條件：小球藻的生態(tài)條件依種類而不同。1、鹽度 微綠球藻對鹽度的適應性很廣，可以在436的范圍中生長繁殖，并可保存在254的水中。 2、溫度 微綠球藻在1036的溫度范圍內都能比較迅速地繁殖，最適溫度范圍在25-30。3、光照 最適光照強度約在10000勒克斯左右。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.5之間。微綠球藻在有機質豐

7、富，特別是氮肥多，氨鹽豐富的水中生長特別繁茂。五、 塔胞藻塔胞藻在分類上屬于綠藻們，綠藻綱，團藻目，衣藻科，塔胞藻屬。形態(tài)特征：塔胞藻的藻體多數(shù)梨形、側卵形，少數(shù)半球形。頂端具一圓錐形凹陷。鞭毛4條由凹陷處生出。杯狀色素體，少數(shù)網狀。有一個蛋白核，眼點位于細胞的一側或無眼點。單核，位于細胞的中央偏前端。細胞不具細胞壁。塔胞藻易于培養(yǎng)，一般采用扁藻的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液配方。其耐溫下限比扁藻低。細胞生長良好時集群上浮，形成如扁藻一般的藻團。第二節(jié) 硅藻一、 三角褐指藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）在分類上屬于硅藻們，羽紋藻綱，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻

8、屬。形態(tài)特征：褐指藻有卵形、棱形和三出放射形三種。這三種不同的形態(tài)可以在不同的生長條件下轉化。在正常的培養(yǎng)條件下，主要是三出放射形和少量的棱形細胞，這二種形態(tài)都沒有硅質的細胞壁。三出放射形細胞長度約為1018微米，棱形細胞長約20微米，兩臂末端較鈍。卵形細胞長約8微米，寬3微米，只有一個硅質殼面，也沒有殼環(huán)帶。繁殖方式：一般是通過細胞平行分裂形成2個形態(tài)相同的子細胞。因為沒有硅質殼，所以分裂是與一般的硅藻不同，藻體不會縮小。生態(tài)條件：1、鹽度 廣鹽性，在992鹽度的水中均能生長繁殖。最適鹽度在2532之間。 2、溫度 在525的范圍內均能生長繁殖，最適范圍在1020之間。3、光照 光照強度為1

9、0008000勒克斯范圍內都能生長繁殖，最適光照強度約在30005000勒克斯之間，在小型培養(yǎng)時忌陽光直射。4、酸堿度 一般在pH710的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。二、 小新月菱形藻小新月菱形藻（Nitaschia closterium minutissima Allen et Nelson）是新月菱形藻的一個類型，俗稱“小硅藻”。在分類上屬于硅藻門，羽紋綱，雙菱形目，菱形藻科，菱形藻屬。形態(tài)特征：細胞紡錘形，中央膨大，兩端漸尖，朝同一方向彎曲成月牙形。細胞長度約為1223微米，寬23微米。細胞中央有一個細胞核。2個色素體，黃褐色，位于細胞核的兩側。繁殖方式：行縱分

10、裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 廣鹽性，在1861.5鹽度的水中均能生長繁殖。最適鹽度在2532之間。 2、溫度 在528的范圍內均能生長繁殖，最適范圍在1520之間。3、光照 最適光照強度約在30008000勒克斯之間，在小型培養(yǎng)時忌陽光直射。4、酸堿度 一般在pH710的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。三、 角毛藻角毛藻的培養(yǎng)種類有牟氏角毛藻、鈣質角毛藻、纖細角毛藻等。在分類上屬于硅藻門，中心綱，盒形藻綱，角毛藻科，角毛藻屬。形態(tài)特征：細胞小形，細胞壁薄。大多數(shù)是單個細胞，也有數(shù)個細胞集成群體的。殼面橢圓形至圓形，中間略突起或少數(shù)平坦。殼環(huán)面呈長方形至四角形。環(huán)面觀一般細

11、胞大小是3.454.6微米×4.69.2微米。殼環(huán)帶不明顯。角毛細而長，末端尖。培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)常有變化，細胞中間膨大，角毛縮短或消失。繁殖方式：一般為無性的二分裂繁殖。環(huán)境不良是可形成休眠孢子，一個母細胞形成一個休眠孢子，也可形成增大孢子。生態(tài)條件：1、鹽度 牟氏角毛藻為沿岸性半咸水種類，在2.5635鹽度的水中均能生長繁殖。最適鹽度范圍低于正常海水鹽度。纖細角毛藻的最適鹽度在1535之間。 2、溫度 在530的范圍內生長率隨溫度的上升而增加，超過3則開始下降。纖細角毛藻的最適范圍在2830之間。3、光照 牟氏角毛藻在50025000勒克斯的范圍內均能生長繁殖，最適光照強度約在1

12、000015000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH6.49.5的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH8.08.9之間。四、 中肋骨條藻中肋骨條藻（Skeletonema costatum）在分類上屬于硅藻門，中心綱，圓篩藻目，骨條藻科，骨條藻屬。形態(tài)特征：細胞為透鏡形或圓柱形，直徑67微米。殼面圓而鼓起，周緣有一圈細長的刺，與鄰細胞的對應刺相連接組成長鏈。細胞核在細胞的中央。有110個色素體，但通常是2個。繁殖方式：一般為無性的二分裂繁殖。增大孢子圓形，直徑為母細胞的23倍。生態(tài)條件：1、鹽度 在750鹽度的水中均能生長繁殖。最適鹽度范圍在1530之間。 2、溫度 在1034的范圍內均可生存

13、，最適范圍在2030之間。3、光照 在50010000勒克斯的范圍內均能生長繁殖，最適光照強度約在100005000勒克斯之間。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.5之間。第三節(jié) 金藻一、 球等邊金藻球等鞭金藻（Isocrydid galbana）在分類上屬于金藻門，普林藻綱，等鞭藻科，等鞭藻屬。其中OA-3011是球等鞭金藻的一個高溫品系。形態(tài)特征：球等鞭金藻細胞裸露，形狀多變，但大多數(shù)呈橢圓形，幼細胞有一略扁平的背腹面，側面觀為長橢圓形或長方形。鞭毛2條，等長，由細胞前端生出，其長度為細胞的12倍。鞭毛基部有液泡。細胞內有一二個側生的色素體，其形狀和位置往往隨著細胞的變化而變化。有一個細

14、胞核，通常位于細胞的中央。細胞長4.47.1微米，寬2.74.4微米，厚2.43微米。能活潑游動。繁殖方式：主要行無性二分裂繁殖。環(huán)境不良時形成特殊的內生孢子，環(huán)境變好時，內生孢子分裂成16個新的藻體放出。生態(tài)條件：1、鹽度 球等鞭金藻OA-3011在純淡水中不能生長，從鹽度010生長率急劇上升達到最高峰，以后直到30，其生長率幾乎無變化，超過30生長減慢。 2、溫度 球等鞭金藻OA-3011在1035的范圍內均能生長繁殖，最適范圍在2028之間。3、光照 球等鞭金藻OA-3011的最適光照強度約在70009000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.

15、58.5之間。二、 湛江等鞭金藻湛江等鞭（Isochrysis zhangjiangensis）在分類上屬于金藻門，普林藻綱，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻屬。形態(tài)特征：細胞卵形或球形，大小為67微米×56微米。細胞表面具有幾層體鱗片，在細胞前端表面有一些小鱗片。鞭毛2條，等長，由細胞前端生出，二條鞭毛之間有一條附鞭。鞭毛基部有液泡。二片周邊色素體呈金黃色，每個色素體內含一個無淀粉鞘而僅一層膜包圍的蛋白核。一到幾個白糖素顆粒位于細胞中部或前端。繁殖方式：主要行無性二分裂繁殖。環(huán)境不良時形成膠群體。生態(tài)條件：1、鹽度 最適鹽度約在22.735.8之間。 2、溫度 在935的范圍內均能生長繁

16、殖，最適范圍在2532之間，達到37時死亡。3、光照 在100031000勒克斯的光照范圍內均能正常的生長繁殖，最適光照強度約在500011000勒克斯之間。4、酸堿度 一般在pH69的范圍內均能生長繁殖，最適范圍約在pH7.58.5之間。三、 綠色巴夫藻 綠色巴夫藻（Pavloca viridis）在分類上屬于金藻門，普林藻綱，巴夫藻目，巴夫藻科，巴夫藻屬。形態(tài)特征：綠色巴夫藻無細胞壁。正面觀圓形，側面觀橢圓形至倒卵形。大小為6微米×4.8微米×4.0微米。細胞中上部生出2條不等長的鞭毛和一條附鞭。長鞭毛上有許多小的圓形鱗片覆蓋，長度是細胞體長的1.52倍，短鞭毛光滑，不

17、發(fā)達，僅0.3微米，向后彎曲成鉤形，位于二鞭毛之間。一個色素體裂成二大片圍繞著細胞。細胞核在細胞上部。無蛋白核和眼點。群體細胞成淡黃綠色至綠色。有微弱趨光性。繁殖方式：行無性二分裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 對鹽度的適應范圍極廣，在580的鹽度范圍內都能生長，最適鹽度約在1040之間。 2、溫度 適溫范圍廣，在-3不會凍死，在1035的范圍內均能生長繁殖。從1530生長率變化很小。3、光照 最適光照強度約在400010000勒克斯之間。第四節(jié) 藍藻一、 螺旋藻常用于培養(yǎng)的螺旋藻有鈍頂螺旋藻、極大螺旋藻和鹽澤螺旋藻。螺旋藻在分類地位上屬于藍藻門，藍藻綱，藻殖段目，顫藻科，螺旋藻屬。形態(tài)特征：藍藻類

18、細胞無色素體，色素分布在原生質體外部的色素區(qū)，藍綠色。原生質體內部有一無色的中央區(qū)，類似其他藻類的細胞核，但無核仁和核膜，因此螺旋藻是原核植物。鈍頂螺旋藻為絲狀體，藻絲螺旋狀，無橫隔壁，藍綠色。藻絲寬45微米，長400600微米。藻絲的頂端細胞鈍圓，無異形胞。繁殖方式：行無性二分裂繁殖，繁殖結果使藻絲長度迅速增加。鈍頂螺旋藻主要靠藻絲斷裂增加絲狀體的數(shù)量，有時也形成“藻殖段”，藻殖段細胞分裂成新的螺旋狀藻絲。生態(tài)條件：1、鹽度 鈍頂螺旋藻原生長在堿性水中，可以被馴化培養(yǎng)在正常的海水中。 2、溫度 最適范圍在3037之間。3、光照 最適光照強度約在3000035000勒克斯之間。4、酸堿度 最適

19、范圍約在pH8.69.5之間。第五節(jié) 黃藻一、 異膠藻異膠藻（Hdterogloea sp.）在分類上屬于黃藻門，黃藻綱，異囊藻目，異囊藻科，異膠藻屬。形態(tài)特征：異膠藻細胞多為長圓形或橢圓形。一塊側生的黃綠色色素體，幾乎占細胞的大部分。無蛋白核。細胞寬2.54微米，長44.5微米。繁殖方式：行無性二分裂繁殖。生態(tài)條件：1、鹽度 在鹽度1331的水中均能正常生長繁殖，最適鹽度為2029。 2、溫度 一般在835的范圍內都能正常生長，最適范圍在1533之間。3、光照 最適光照強度約在30005000勒克斯之間。4、酸堿度 最適范圍約在pH7.58.2之間。第二章 藻種的分離技術第一節(jié) 采樣方法水樣

20、可以取自任何有可能生長所需單胞藻的水體，通常在海岸邊退潮后留下的小水洼中或者在養(yǎng)殖場、鹽場等地方的小水坑中，生長有適合靜水培養(yǎng)的單胞藻類，而且比較純。在實驗場、育苗場的一些水池、水桶中都有可能出現(xiàn)比較純的藻類。采樣時要同時測定水樣的溫度和鹽度，供分離、培養(yǎng)時參考。水樣采回后，進行現(xiàn)微鏡檢查，如果需要分離的藻類比較多，可以立即進行分離。如果在水樣中有需要的藻類，但是數(shù)量不多，就要進行預培養(yǎng)，待其繁殖起來后再分離。預培養(yǎng)可以用500ml的三角燒瓶，加入150ml的培養(yǎng)液，然后把經350目篩絹過濾的水樣150ml接種進去，在一定的溫度和光照下靜止培養(yǎng)，每天搖動12次。用作預培養(yǎng)的培養(yǎng)液，可選擇各類藻

21、類通用的培養(yǎng)液配方或者同時采用幾種不同藻類的培養(yǎng)液同時分別培養(yǎng)。預培養(yǎng)的培養(yǎng)液的濃度應小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分離的藻類的最適生長條件是已知的，那就在其最適的光照和溫度下培養(yǎng)。如果不知其最適生長條件，那就在人為設定的條件下培養(yǎng)，以便適應應用時的特定環(huán)境。第二節(jié) 分離方法一、 微吸管分離法用直徑0.5厘米、長35厘米的普通玻璃管，在中央部分加熱，拉長610厘米，使玻璃管的直徑縮小至0.060.1厘米，把它折斷后即成二個吸管。把一團棉絮塞進吸管的寬大一端，然后放入高壓滅菌器中消毒。消毒后，再在酒精燈上加熱吸管的細端，用鑷子拉成極細的微管，直徑縮小至0.080.16毫米即可。微吸

22、管在入水的瞬間，因毛細管的作用會吸入微量的水。將藻液水樣放在凹玻片上，在顯微鏡下用微吸管仔細地吸出單個藻體，滴在載玻片上，在顯微鏡下確認是所要分離的單個藻體后，移入經滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。二、 平板分離法按所要分離的藻類的特性，選用合適的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入11.5%的瓊脂，加熱將瓊脂溶化。加熱后要加淡水補充蒸發(fā)掉的水分。然后，按照微生物學中固體培養(yǎng)基的制作方法倒平板、滅菌。在無菌操作箱中，用接種針蘸取少量藻液，在固體培養(yǎng)基上劃蛇形線，藻細胞就會散布在瓊脂培養(yǎng)基的表面。另一種使藻細胞散布在培養(yǎng)基表面的方法是用醫(yī)用口腔噴霧器，將經稀釋的藻液噴在培養(yǎng)基的表面。將接種好的培養(yǎng)皿放在有適合的光照和溫度

23、的地方培養(yǎng)。一般經過十來天的培養(yǎng)就會在培養(yǎng)基上長出相互間隔的藻落。通過顯微鏡檢查，找出所要的純的藻落，再用已消毒的接種針從培養(yǎng)基上挑取藻體，移入經滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。三、 水滴分離法 先將欲分離的藻液稀釋，用微吸管將少量藻液吸出，滴在載玻片上，每張載玻片上可以滴數(shù)滴。水滴大小以在低倍顯微鏡下一個視野能包括整個水滴為準。在顯微鏡下逐個觀察水樣，挑選水滴中只有所要分離的單個藻體，而沒有其他任何雜藻或小動物的，移入經滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。四、 稀釋分離法用已消毒的試管5支，在第一支試管中加蒸餾水10毫升，第二和第五支試管都加5毫升，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，在第一支試管中滴入混合藻液1滴，充分震蕩，使

24、其均勻稀釋。再用經消毒的吸管從第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中，充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個試管。再取5個已裝有消毒的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，加熱使培養(yǎng)基熔化，待冷卻而尚未凝固時，分別滴入5個試管中的藻液各1滴，用力震蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。等冷凝后將培養(yǎng)皿放在適合的條件下，直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)藻落。在稀釋適當?shù)呐囵B(yǎng)皿內，藻落和細菌群落會充分分離。再在無菌條件下將選取單個藻落接種到固體培養(yǎng)基的表面，再培養(yǎng)。重復數(shù)次，直至得到純的藻落。第三章 藻種的保存技術保存藻種時可以根據(jù)保種目的和保種條件的不同分別采取不同的保種方法。第一節(jié) 固體培養(yǎng)基保存法此法通常把藻種接種在固體培養(yǎng)基上

25、，在弱光低溫條件下保存，接種一次可以保存半年到一年。保種用的固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)濃度應比正常的液體培養(yǎng)液的高，一般增加一倍。瓊脂量為11.5%。保種用的培養(yǎng)容器可用三角燒瓶、試管和克氏扁瓶。固體培養(yǎng)基分裝滅菌后，冷卻待用。將無污染的藻種用噴霧法或劃線法接種到固體培養(yǎng)基上，在弱光條件下，讓細胞在培養(yǎng)基上慢慢地生長繁殖，可保存半年到一年?？蛇M行低溫保存的藻種，最好在低溫環(huán)境中保存。接種后，首先放在光線充足的地方（防止直射光照射），使藻類細胞較快速地繁殖起來，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)顏色，即可放入冰箱或冷庫中，一般在5左右的低溫下保存。當然，不同的藻種保存的溫度也不盡相同。每天應給藻種幾個小時的弱光照。此法保存

26、的時間可長達2至3年。如新月菱形藻可保存34個月，三角褐指藻可保存25個月，角毛藻和骨條藻可保存9個月。第二節(jié) 循環(huán)移養(yǎng)保存法此法采用的容器一般為三角燒瓶（300毫升、500毫升、1000毫升等）和細口瓶（10000毫升、20000毫升等），將容器、工具消毒后，加入正常濃度的培養(yǎng)液，接種后瓶口用消毒的濾紙包扎，放在適宜的溫度和光照條件下培養(yǎng)。白天搖動瓶子數(shù)次。一般510天即可移樣一次。此法簡單、容易掌握，而且保存的藻種活力強、純度高、數(shù)量大。第四章 單胞藻的豐富培養(yǎng)技術第一節(jié) 容器、工具的消毒為防止單胞藻在培養(yǎng)過程中被污染，培養(yǎng)用的容器和工具都必須經過消毒。消毒和滅菌的定義是有區(qū)別的。滅菌是指

27、殺死一切微生物，包括營養(yǎng)體和芽孢；消毒則只殺死營養(yǎng)體，不殺死芽孢。保種需達到滅菌的程度，而生產性培養(yǎng)只需消毒就可以了。常用的消毒方法有高溫消毒法和化學藥品消毒法。一、 高溫消毒法高溫消毒法是利用高溫殺死微生物的方法。不耐高溫的容器如塑料和橡膠制品等不能利用高溫法消毒。1、直接灼燒滅菌 接種環(huán)、鑷子等金屬小工具，試管口、瓶口等可以直接在酒精燈火焰上灼燒滅菌。載玻片、小刀等則最好先蘸酒精，然后在酒精燈火焰上點燃，等器具上的酒精燒完，也就完成了滅菌操作。2、煮沸消毒 把容器、工具放入鍋中，加水煮沸消毒，一般煮沸510分鐘。大型錐形瓶消毒，可在瓶口上放一普通的玻璃漏斗，再在漏斗上放一稱量瓶蓋，在錐形瓶

28、內加少量淡水，置電爐上加熱煮沸510分鐘，可使整個瓶壁消毒。消毒完畢即用消毒的紙或消毒的紗布包扎瓶口。此法適合消毒小型的容器工具。如果在水中加1%的碳酸鈉效果更好。3、烘箱干燥消毒 將玻璃容器、金屬工具用清水洗干凈后，放入烘箱。關閉烘箱門，打開箱頂上的通氣孔，接通電源加熱。當溫度上升到120時，關閉通氣孔，停止加熱。如果進行純培養(yǎng)，容器必須滅菌，當溫度上升到105時，關閉通氣孔，繼續(xù)加熱至160，保持溫度，恒溫2小時，然后停止加熱。必須要等到溫度下降到60以下，才能打開烘箱門。4、高溫蒸汽滅菌 AAAAAAA二、 化學藥品消毒法在生產性大量培養(yǎng)中，大型容器、工具、水泥池等常用化學藥劑消毒。1、

29、酒精 能使蛋白質凝固而起殺菌作用。濃度為70%時，酒精的殺菌能力最強。酒精消毒常用于中小形容器和工具，方法是用紗布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹，幾分鐘后用消毒水沖洗。2、高錳酸鉀 高錳酸鉀又稱灰錳氧，紫色針狀結晶，易溶于水，是一種強氧化劑，能使蛋白質變性，殺菌能力很強。高錳酸鉀溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配。消毒時將容器、工具等浸泡在新配的300ppm濃度的高錳酸鉀溶液中5分鐘，然后取出用消毒水沖洗23次。如果是對玻璃鋼水槽、水泥池等消毒，可以用0.05%濃度的高錳酸鉀溶液撥在池壁上，撥灑幾遍后刷洗池底，10分鐘后再用消毒水沖洗干凈。3、石炭酸 石炭酸主要破壞細胞膜，并使蛋白質變性。消毒按3%5%的比例配成消

30、毒液，把要消毒的容器和工具放在其中浸泡半小時，再用消毒水沖洗23次。4、鹽酸 取工業(yè)鹽酸1份，加淡水9份，配成10%的鹽酸溶液。容器、工具放入鹽酸溶液中浸泡5分鐘，取出用消毒水沖洗2次。5、漂白粉或漂白液 工業(yè)上用的漂白粉一般含有效氯30%35%，消毒時配成含有效氯為0.01%0.03%的溶液，把容器、工具在溶液中浸泡半小時再用消毒水沖洗34次即可。第二節(jié) 培養(yǎng)用海水的消毒消毒海水時可根據(jù)培養(yǎng)的目的和方式選用以下方法之一。1、加熱消毒法 經沉淀、過濾的海水，一般加溫至90左右維持5分鐘或達到沸騰即可。由于海水中的一些對藻類生長有促進作用的有機物在高溫時易遭破壞，所以加溫時間不宜太長。2、過濾除

31、菌法 把經沉淀的海水先經砂濾，把大型生物和非生物雜質去除，再用陶瓷過濾罐過濾，除去微小生物。3、次氯酸鈉消毒法 按每立方米海水20毫克有效氯的量加入次氯酸鈉溶液，充氣10分鐘后停氣，經67小時消毒后，按每立方米水體25克的量加入硫代硫酸鈉，強充氣46小時，用硫酸-碘化鉀-淀粉溶液測試，若無余氯即可使用。4、紫外線消毒 有成型的紫外線消毒器可供選用。但此法不易殺滅較大的浮游動物。最好和過濾法結合使用。第三節(jié) 接種接種就是把作為藻種的藻液接入新配好的培養(yǎng)液中，進行豐富培養(yǎng)。接種的過程雖然簡單，但要注意藻種的質量、藻種的密度、接入藻液的數(shù)量以及接種的時間等問題。1、藻種的質量 藻種的質量對培養(yǎng)結果的

32、影響很大，一般要求藻種無污染、生長旺盛、藻液的顏色正常、藻液中無沉淀、細胞無附壁。2、藻種的密度和接種數(shù)量 藻種藻液的密度應達到或接近可以收獲的密度。接種后藻細胞在新培養(yǎng)液中應該達到較大的密度，這樣有利于細胞在培養(yǎng)液中形成優(yōu)勢群體，不易出現(xiàn)污染，縮短培養(yǎng)周期。一般來說小型培養(yǎng)時藻種液和新培養(yǎng)液的比例為1:21:3，而中繼培養(yǎng)和大量培養(yǎng)時，其比例可以提高到1:101:20。3、接種的時間最好在上午的810時，這個時間是藻類細胞代謝最旺盛的時候。而傍晚到夜間，多種藻類有細胞下沉現(xiàn)象，不宜接種。第四節(jié) 培養(yǎng)一、培養(yǎng)方式 單胞藻的培養(yǎng)方式有多種多樣，可以根據(jù)不同的培養(yǎng)目的和不同的培養(yǎng)條件來選擇不同的方

33、法。只要是能夠充分滿足單胞藻的生長條件，在培養(yǎng)期間沒有污染，便于操作，能達到培養(yǎng)目的的方法就是可取的方法。常用的培養(yǎng)方法從不同的角度可以大概地進行以下分類。1、純培養(yǎng)和單種培養(yǎng) 純培養(yǎng)即無菌培養(yǎng)，是沒有任何其他一切生物的單種培養(yǎng)。單種培養(yǎng)是不排除細菌存在條件下的單一藻種的培養(yǎng)。2、充氣培養(yǎng)和不充氣培養(yǎng) 充氣培養(yǎng)一般是在高密度培養(yǎng)時采用，用充氣的方式補充培養(yǎng)液中的二氧化碳。3、開放式培養(yǎng)和封閉式培養(yǎng) 開放式培養(yǎng)的容器是敞開的，由于有充足的光照和空氣流通，一般來說藻類的生長比較快，但是容易被污染。封閉式培養(yǎng)是將藻類培養(yǎng)在封閉的玻璃瓶、透明圓柱形容器、透明塑料薄膜袋等容器中，容器除了充氣管、加液管和

34、藻液抽出管外，不與外界接觸。封閉式培養(yǎng)由于污染少，培養(yǎng)的成功率很高。 4、一次性培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) 一次性培養(yǎng)是指培養(yǎng)液中的藻類長起來后一次性采收。如果當藻類達到一定的密度時只采收了一部分藻液，又加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，成為半連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)一般為室內的封閉培養(yǎng)，有人工光源，充氣，培養(yǎng)的藻類在優(yōu)化的條件下快速生長繁殖，培養(yǎng)液從一端連續(xù)流入，一定密度的藻液則從另一端連續(xù)流出。連續(xù)培養(yǎng)的流量是可以人為控制的。 5、小型培養(yǎng)和大面積培養(yǎng) 小型培養(yǎng)的目的是為生產性培養(yǎng)提供藻種。一般培養(yǎng)容器為10003000毫升的三角燒瓶，一消毒的白紙或紗布包扎瓶口，一般是不充氣的封閉式一次性培養(yǎng)。比小型培養(yǎng)的規(guī)模大一些

35、的是中繼培養(yǎng)，目的是培養(yǎng)大量的高純度藻種，為生產性培養(yǎng)提供大量的藻種，培養(yǎng)容器的體積在幾升到幾百升之間，一般是封閉式半連續(xù)培養(yǎng)。在大型的玻璃鋼水槽、水泥池中的培養(yǎng)則是生產性的大面積培養(yǎng)，容易污染，往往是充氣的開放式一次性培養(yǎng)。二、日常管理培養(yǎng)單胞藻的日常管理包括以下幾個內容。1、攪拌和充氣 通過攪拌和充氣使空氣中的二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，促進藻類細胞的光合作用，另外可以幫助沉底的細胞上浮獲得光照。在培養(yǎng)中可以根據(jù)具體情況分別采用搖動、攪拌或充氣的方法。2、調節(jié)光照 光強和光周期對藻類生長的影響非常大，培養(yǎng)時必須根據(jù)培養(yǎng)種類對光照的要求采取擋光、遮光或增加人工光照等措施使培養(yǎng)物得到適合的光照。3

36、、每一種藻類都有最適的溫度范圍，為了保證培養(yǎng)藻的快速生長，必須為其提供適宜的溫度。如是室外的大面積培養(yǎng)，當季節(jié)變化，氣溫不適合原來培養(yǎng)的藻類時，必須更換其他適當?shù)姆N類。4、注意pH值的變化 隨著藻類細胞對營養(yǎng)鹽的不平衡吸收，培養(yǎng)液的pH值會發(fā)生變化，有時這種變化會在短時間內發(fā)生。當培養(yǎng)液的pH值超出藻類的最適范圍時，就會抑制藻類的生長。因此，在日常管理中要格外關注培養(yǎng)液pH值的變化?？梢杂?當量濃度的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液來調節(jié)培養(yǎng)液的pH值。5、防止污染 在開放式培養(yǎng)中，要注意防止污染。三、生長情況的觀察和檢查在日常培養(yǎng)工作中，必須每天定時全面地檢查藻類的生長情況。藻類生長的好壞，可以通過以

37、下觀察得知。1、顏色 顏色的觀察很重要，綠藻類生長繁殖良好時，隨著密度的增加，培養(yǎng)液由嫩綠到深綠色。三角褐指藻、新月菱形藻正常生長時藻液呈褐色，藻體懸浮于水中形成云霧狀水團，隨著密度的增加，由淺褐色到深褐色。金藻生長良好時呈金褐色。接種后，隨著藻類的細胞濃度逐漸增加，正常情況顏色由淺變深。若顏色由深變淺則可能是由于環(huán)境因子不適宜引起的；若出現(xiàn)其他顏色，如藍色、黃色、乳白色等，說明被污染了。2、運動和沉淀 具有運動能力的藻類在水中有一定的分布特點。硅藻類生長良好時會在水中形成云霧狀水團；金藻雖然有鞭毛，但運動緩慢，一般不會迅速上浮，而是形成趨光帶，細胞群成線狀上浮。當環(huán)境不適時，藻類會下沉形成沉

38、淀，當環(huán)境變好時則上浮。如果在環(huán)境條件正常時藻液大量沉底，出現(xiàn)沉淀，而且經過攪拌后又很快下沉，則是不正?，F(xiàn)象。沉淀藻體的顏色如果保持原色，說明還沒有死亡，有可能恢復正常生長。如果藻體變成灰白色，則藻類已死亡。造成藻類沉淀的原因是多方面的，但主要的原因是環(huán)境不良或營養(yǎng)不足使藻類的生長受到抑制。3、附壁 生長良好的單胞藻不附壁，若附壁則說明環(huán)境不適，生長不良。4、水面出現(xiàn)菌膜說明有細菌或真菌生長。第五章 單胞藻的培養(yǎng)液每一種單胞藻對營養(yǎng)的要求都有其獨特性，因而需要有特定的培養(yǎng)液配方來滿足特定藻類的營養(yǎng)需求。另外，即使是同一種藻，采取不同的培養(yǎng)方式時其營養(yǎng)鹽的配方也可能是不一樣的。第一節(jié) 培養(yǎng)液配方

39、一般來說，在配制營養(yǎng)鹽的海水中已經有藻類所需的各種營養(yǎng)成分。在配制培養(yǎng)液時只需添加某些在培養(yǎng)中容易缺乏的營養(yǎng)元素即可。國內外使用的單胞藻培養(yǎng)液的配方數(shù)量眾多，這里僅介紹一些在生產性培養(yǎng)中常用的配方。一、 海洋單胞藻培養(yǎng)液配方 1、一般用培養(yǎng)液配方NaNO3 0.03克CO(NH2)2 0.03克KH2PO4 0.005克FeC6H5O7(1%溶液) 0.2毫升維生素B1 200微克維生素B12 200毫微克人尿 1.5毫升海水 1000毫升培養(yǎng)綠藻、金藻、硅藻使用，培養(yǎng)硅藻時添加0.02克/升硅酸鈉。2、綠藻培養(yǎng)液配方2.1 海洋3號扁藻培養(yǎng)液NaNO3 0.1克K2HPO4 0.01克Fe(SO4)3 (1%溶液) 10滴2Na3C6H5O7.11H2O 0.02克海水 1000毫升 2.2 亞心形扁藻培養(yǎng)液 NaNO3 0.05克KH2P