細(xì)胞工廠生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗的應(yīng)用研究.docx

1、細(xì)胞工廠生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗的應(yīng)用研究劉學(xué)平，魏至棟，謝澎，龐興，任雅萍(蘭州生物制品研究所，蘭州730046)摘要：為了確定用細(xì)胞T廠生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗的工藝參數(shù)和質(zhì)控點(diǎn)，將原代牛腎細(xì)胞按2010,個(gè)：接種到細(xì)胞工廠培養(yǎng)，待形成R好單層后按410,個(gè)/to:連續(xù)傳代2次后接種輪狀病毒，并與轉(zhuǎn)瓶作對(duì)照果麻，用細(xì)胞工廠生產(chǎn)口服輪狀病毒活疫苗與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)無差異，細(xì)胞工廠可用于改進(jìn)口服輪狀病毒活疫苗的生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：細(xì)胞工廠;牛腎細(xì)胞；輪狀病毒疫苗中圖分類號(hào)：R373-2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1005-573(2011)04001304SajSTAiKLIUX-,WEI-,XIEP.(LIBP,

2、L730046.C)Aa:TodeterfiineCeparame&sandfietimepointofquaiitycorlrofofroGvirusvaccineliiatisproduoedtyCaf-STACK_TueautvationoffieprimarycaifiidncdtswasprocesedintieCdiSTACKandcomparedwitiitieciiiturehyroiie-b»tie.wasinoculatedintoceiswiientieaoodmornlayerwasifmtd_Tiiersuitsiiavedtuattieeisrnd

3、i"fcoiceeaitilequalityofvacdnspreducedwitiitwotecuniqus.tieCeiST/CKanbeusedfflaeproduefonofvaccine.K:CaiSTACK;BovineSidneycdf;Rotavirusvacine蘭州生物制品研究所生產(chǎn)的U服輪狀病毒活疫苗（LLR株）的細(xì)胞基質(zhì)為新生小牛腎細(xì)胞m,培養(yǎng)容器為15L轉(zhuǎn)瓶，由于轉(zhuǎn)瓶占用外圍空間較多，勞動(dòng)強(qiáng)度較大，若用細(xì)胞工廠代替轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，將會(huì)提高生產(chǎn)廠房的使用效率，同時(shí)減少轉(zhuǎn)瓶個(gè)體間的差異，可提高口服輪狀病毒活疫苗質(zhì)量的均性，此，對(duì)t-腎細(xì)咆在細(xì)胞工廠培養(yǎng)時(shí)的條件進(jìn)行摸索

4、，并將細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)進(jìn)行比較果表明，牛腎細(xì)胞按適宜密度接種到細(xì)胞工廠進(jìn)行培養(yǎng)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)能形成良好單層，口服輪狀病毒活疫苗原液滴度與轉(zhuǎn)瓶之間無差異材料和方法1材料1-1牛腎采自出生12d的健康小公牛1-2消化液0.2卵胰酶溶液，胰蛋白酶購自美國DFC0公收稿日期：2011-03-0*:修回日期：20ll-!0-16基金項(xiàng)目:國家科技支撐計(jì)劃（200IBA1SB04-01）作者簡(jiǎn)介：劉學(xué)平（1973-）,男，大學(xué)本科，醫(yī)學(xué)生物學(xué)高級(jí)工程師,主要從事材毒類疫苗的研究及生產(chǎn)工藝改進(jìn)通信作者：翅至棟Te-mail：wzdsc163.con司，溶液自配。1-3培養(yǎng)液水解乳

5、蛋白-mem液（含小牛血清和慶大霉素），MEM和水解乳蛋白均為GEC0產(chǎn)品；小牛血清購自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司；慶大霉素為安陽路德藥業(yè)有限公司出品1-4細(xì)胞工廠美國CORNMG公司生產(chǎn)，每層培養(yǎng)面積為636on:;美國塞莫飛公司生產(chǎn)（NUNC）,每層培養(yǎng)面積為632on1.5轉(zhuǎn)瓶（15L）四川萬福玻璃儀器有限責(zé)任公司出品，有效培養(yǎng)表面積為28001王疫苗病毒株羊輪狀病毒LLR毒株。1 -7實(shí)驗(yàn)用疫苗批號(hào)201003）4;20100601;20100607;20100801;201008022方法-1原代牛腎細(xì)胞的制備'J無菌摘取12d新生小牛腎，剪碎成0.S1-0mm小塊后用胰蛋

6、白酶消化制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按2010個(gè)E'分別接種到5層細(xì)胞工廠和15L轉(zhuǎn)瓶上培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)形成單層（成片率高于90%）為原代牛腎細(xì)胞（P0）。2.2傳代牛腎細(xì)胞的制備原代牛腎細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)形成單層后，吸去培養(yǎng)液，用0.2+胰酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化凹，在消化液的作用下,細(xì)胞圓縮呈球形時(shí)終止消化，棄去消化液，加入少量含10%新生牛血清培養(yǎng)液收集細(xì)胞，輕輕搖晃，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)后按410'個(gè)/61'分別接種到10層細(xì)胞工廠和15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)（P1代），P1代細(xì)胞形成單層后再次消化，按410'個(gè)火分別接種到40層細(xì)胞工廠和1SL轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培

7、養(yǎng)（R代）。2-3細(xì)胞計(jì)數(shù)方法13心采用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。2-4口服輪狀病毒活疫苗原液制備P2代牛腎細(xì)胞培養(yǎng)形成單層后，用Ean-s液沖洗2遍，接種輪狀病毒液，置于37孵房培養(yǎng)，待細(xì)胞發(fā)生病變后收毒2.5病毒滴度測(cè)定以CCDEA&法（半數(shù)細(xì)胞感染劑量-酶聯(lián)法）,測(cè)定病毒的滴度。結(jié)果1牛腎細(xì)胞在細(xì)胞工廠上的生長(zhǎng)情況以原代牛腎細(xì)胞按2010個(gè)接種到細(xì)胞工廠和15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)時(shí),8d均能形成良好單層，單位面積收獲的細(xì)胞數(shù)量在細(xì)胞工廠和轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的結(jié)果基本一致,CORNAG細(xì)胞工廠培養(yǎng)的5批結(jié)果平均為18.91（?個(gè)/bn',NUNC細(xì)胞工廠培養(yǎng)的5批結(jié)果平均為19.9810

8、個(gè)ybnlSL轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的S批結(jié)果平均為19.8210個(gè)/Cm：,相互間無差異（0-05）,見表1他傳代按410個(gè)接種到細(xì)胞工廠和15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)時(shí),4d均能形成良好單層，以單位面積的收獲細(xì)胞數(shù)量做比較，細(xì)胞工廠和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的結(jié)果也基本一致，CORNT4G細(xì)胞工廠培養(yǎng)的P1的細(xì)胞收獲數(shù)量為16.8410：個(gè)處的細(xì)胞收獲數(shù)量為16.M10個(gè)如氣NUNC細(xì)胞工廠培養(yǎng)的P1的細(xì)胞收獲數(shù)量為17.310個(gè)知：的細(xì)胞收獲數(shù)量為17.7810*個(gè)/an：,15L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的Pl的細(xì)胞收獲數(shù)量為17.310個(gè)勺細(xì)胞收獲數(shù)量為】7610個(gè)/tin：,細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶之間無差異（0.05,見表1。表1牛腎細(xì)胞在細(xì)胞工

9、廠上的增殖結(jié)果TatxlTiiereultofiiearavtioffiieSidneycdiinCeiSTACKVcsaBatiiP°Tuenirabe-ofnarvestcdt(1O'/cmrR)RCeiSTACKl2010050418.7016.H)16.80(CORNFJG>2010060119.2016.2017.202010060718.9017.SO16.5D2010080118.6016.8017.002010080219.1017.2016.90Aveaae18.9016J416.88CeiSTACK2010050419-5)16.8017.20(NU

10、NC)2010060120.2017.5017.802010060721.317.0018.502010080120.4017.4017.602010080218.3017J017.80Ao-aae19.9317.3017.78Roiitrt»tie2010050420.5)17.6017.802010060119.3016.9017.202010060720.9017.0017.602010080119.6017.2018.202010080218_8O18.2017.20Atraae19.8217.3017.602輪狀病毒原液的滴度結(jié)果5批輪狀病毒原液的滴度結(jié)果（表2）表明，牛腎

11、細(xì)胞傳代2次后接種輪狀病毒，細(xì)胞工廠和轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的輪狀病毒原液的滴度基本相同，CORN1NG細(xì)胞工廠培養(yǎng)的5批輪狀病毒原液的滴度平均為5.73LaCCD/LUNC細(xì)胞工廠培養(yǎng)的5批輪狀病毒原液的滴度平均為5_83LaCC©,/iL,15L轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的5批輪狀病毒原液的滴度平均為5_87LaCC/iL,由此可見三者之間無顯著性差異（0-05。表2輪狀病毒原液滴度結(jié)果Ta1x2TiiettcrfifbneofrotvirusvaccineVesdTits-AveaaeDi-ftreice201005)420100601201006072010080120100802CeiSTACK5.H

12、)5.805.3)6.255.605.73(CORNtlG)CoiSTACK5.755.506.255.676.005.830.10(NUNC)Roffebitfe5.506.255.756.005.835.870.140.043使用的培養(yǎng)空間與培養(yǎng)液的比較根據(jù)細(xì)胞工廠和15L轉(zhuǎn)瓶提供的培養(yǎng)內(nèi)表面積10個(gè)40層的細(xì)胞工廠提供的細(xì)胞生長(zhǎng)面積相當(dāng)于90個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶提供的細(xì)胞生長(zhǎng)面積，將10個(gè)40層的細(xì)胞工廠放置于孵房培養(yǎng)時(shí)，占地空間僅為0.5m3,而90個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶的占地空間為4.5m氣兩者相差4.0m',細(xì)胞工廠比15L轉(zhuǎn)瓶節(jié)省88.9%的空間;10個(gè)40層細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所需的營養(yǎng)液

13、為72000inL,而90個(gè)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)所需的營養(yǎng)液為148500mL,兩者相差765D0mL,在收獲相同數(shù)量細(xì)胞的情況下，細(xì)胞工廠比15L轉(zhuǎn)瓶節(jié)省9的營養(yǎng)液，見表3表3培養(yǎng)空間與培養(yǎng)液的比較Tab.3TliecomparisonoftieproductionspaceandcuilaremedimCuitireareiFloorarcsSpaceCiiitiiremcdiaVgsaNurr.ktr(cn3)(m?)(m3)(mL)CetiSTACK10254000.70.572000Roiiet>tie90250002.54.5148500Dileence-1J-4.0-76500S

14、averaid%)7288.93.5討論轉(zhuǎn)瓶是目前國內(nèi)用于細(xì)胞培養(yǎng)"疫苗的主要容器，要使細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)盡快均勻貼壁并分裂增殖,須放置在轉(zhuǎn)瓶機(jī)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),轉(zhuǎn)瓶機(jī)占用空間較多，勞動(dòng)強(qiáng)度較大，轉(zhuǎn)瓶機(jī)的故障均會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，從而影響疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量，還由于受培養(yǎng)空間的限制，制約著產(chǎn)量的進(jìn)一步擴(kuò)大蜘工廠是一種新型的細(xì)胞培養(yǎng)容器，材質(zhì)為符合貶國藥典瓷定的聚苯乙烯，采用靜止培養(yǎng)方式，培養(yǎng)表面經(jīng)特殊處理，大大提高了細(xì)胞的吸附性O(shè)由于細(xì)胞工廠培養(yǎng)面積相對(duì)較大，可以節(jié)約操作時(shí)間和培養(yǎng)廠房空間S細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)存在密度依賴，牛腎細(xì)胞在接種密度過低時(shí)，在培養(yǎng)過程中不易形成良好單層，接種密度過高時(shí)，又會(huì)出

15、現(xiàn)密度抑制，不利于牛腎細(xì)胞的有效分裂淄過試驗(yàn)以及參照轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)的接才密度，用細(xì)胞工廠培養(yǎng)牛腎細(xì)胞時(shí)，原代牛腎細(xì)胞按2010*個(gè)知'，傳代牛腎細(xì)胞按4I0'個(gè)/tnr的接種密度進(jìn)行接種比較適宜，在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)牛腎細(xì)胞能形成良好單層，符合口服輪狀病毒活疫苗生產(chǎn)的工藝要求代牛腎細(xì)胞接種輪狀病毒后，經(jīng)IB工廠培養(yǎng)制備的疫苗原液的滴度與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)之間無顯著差異2346文獻(xiàn)資料顯示，國內(nèi)外已有分別用細(xì)胞工廠培養(yǎng)傳代細(xì)胞生產(chǎn)甲肝疫菌*和培養(yǎng)沙鼠腎原代細(xì)咆制備宵綜合癥出血熱滅活疫苗的報(bào)道國未見有細(xì)胞工廠培養(yǎng)牛腎細(xì)胞制備輪狀病毒疫苗的報(bào)道，基于改進(jìn)生產(chǎn)工藝的目的，本文作者對(duì)這種方法進(jìn)行了探索季驗(yàn)結(jié)

16、果表明，用細(xì)胞工廠生正I服輪狀病毒活疫苗是可行的，與轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)相比，能節(jié)省50%的營養(yǎng)液和80%以上的培養(yǎng)空間，也具有減少瓶間差異，提高疫苗質(zhì)量的均一性等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)一步擴(kuò)大產(chǎn)能，滿足市場(chǎng)需求O參考文獻(xiàn):1魚軻.魏至棟，龐興.等-不同代次牛骨原代細(xì)胞培養(yǎng)輪狀荊毒的比較研究UJ-微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2007,35(4)：2-姚偉，伸建琴，蘇波，等.細(xì)胞工廠培養(yǎng)沙鼠腎原代細(xì)胞制備腎綜合癥出血熱滅活疫苗中國生物制品學(xué)雜志.2010.23(6):613-614.劉學(xué)平，沈勁草，蔑至棟.等-牛腎原代細(xì)胞培養(yǎng)最透接種濃度的選擇叫-甘市科技，。的.19:62-63.劉學(xué)平，魏至棟，沈勁草，等牛腎組織及其培弄物

17、的不同消化法效果評(píng)價(jià)-微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展.2010.3(I):30-31.HaaetiAJ.Ali>ud1A.Dquiitip$PA.etaf.UseofimcieiseeineintiepuriNationofrAQTAauq)atitsAVaccineJ-BiotecuroiAppiBiodiem.I996,23:209-215.蘭蓉，周珍輝-細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)M-北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007:17-13.牛.物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展*2年征訂啟事VHs物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展。I：嘩人民共和國衛(wèi)生部主管預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)和蘭州生物制品研究所共I毗如勺中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)系列雜志之一，系一國學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫I源期刊。中國核心期刊(渤數(shù)據(jù)庫VA期刊中國生物學(xué)文摘VX國生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫VA期刊，國內(nèi)外公開發(fā)行73年創(chuàng)刊,主要刊登國內(nèi)外醫(yī)學(xué)里物學(xué)疫學(xué)物化學(xué)傳工程行病學(xué)等方面的