牛病毒性腹瀉病二價弱毒活疫苗制備工藝研究.docx

1、特產(chǎn)研究SpecialWildEconomicAnimalandPlantResearch1文章編號：1001-4721(2013)01-0001-03牛病毒性腹瀉病二價弱毒活疫苗制備工藝研究李海濤，苗利光，劉艷環(huán)，朱言柱，安亞雄，王坤，馮卓(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)摘要:研究了BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3二價弱毒活疫苗的制備工藝。通過對BVDV2/JZQ5-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒傳代培養(yǎng)測定毒價后,試制出5批毒價分別是lOTCHVmL和ITCIIWmL的BVDV二價弱毒活疫苗，經(jīng)檢驗(yàn)符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。關(guān)鍵詞:牛病毒性腹瀉;病毒;活疫苗中圖

2、分類號：1M64文獻(xiàn)標(biāo)識碼:AStudyonPreparationTechniqueofDivalentAttenuatedVirusLiveVaccineofBovineViralDiarrheaVirusLIHai-tao,MIAOLi一guang,LIUYan-huan,ZHUYan-zhu,ANYa-xiong,WANGKun,FENGZhuo(InstituteofSpecialWildEconomicAnimalsandPlants,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130112,China)Abstract:Theaimo

3、fthisstudywastoexplorethepreparationtechniqueofdivalentattenuatedviruslivevaccineofbovineviraldiarrheavirus2/JZ05-1(BVDV2/JZO51)andBVDV1/JZ05-3.BVDV2/JZ05-1andBVDV1/JZ05-3werecontinuouslycultivatedinceUculture.Thepoisontitorwasexamined.5groupsofdivalentattenuatedBVDVlivevaccinewereproduced.Tliepoiso

4、npriceswere105TQDjo/mLandKr'TCIDjo/mlorespectively.Thevaccineswereexaminedandwaswithintherangeofthetestdesignrequirement.Keywords：bovineviraldiarrhea;virus;livevaccine牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)為黃病毒科瘟病毒屬的代表種，主要宿主為牛、羊、豬和鹿等。目前該BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛分布。感染BVDV的臨床癥狀主要有發(fā)熱、腹瀉、黏膜潰瘍、持續(xù)性感染、白細(xì)胞減少、免疫抑制和生殖

5、障礙等。本研究利用已分離鑒定的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗株，根據(jù)疫苗毒的生化特性、繁殖培養(yǎng)條件，選用MDBK細(xì)胞系繁殖高毒價病毒液,試制出5批二價弱毒活疫苗，經(jīng)過相關(guān)檢驗(yàn),結(jié)果符合疫苗生產(chǎn)要求。1材料和方法1.1材料1.1.1 毒種和細(xì)胞BVDV2/JZ05-1.BVDV1/JZ05-3疫苗毒株(-70勾保存,TCIDso不低于伸，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所苗利光博士保存)；MDBK細(xì)胞(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心)。1.1.2 試劑MEM(FisherScientific公司)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津源樣生物制品有限公司);其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。收稿日期：

6、2013-01-16基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃(20100219)作者簡介:李海濤(1981-),男,河北省邯鄲人，碩士，從事動物病原生物學(xué)和分子免疫學(xué)研究。*通訊作者:苗利光,E-mail：mliguang66.1.2方法MDBK細(xì)胞傳代培養(yǎng)將凍存在液氮罐內(nèi)的MDBK細(xì)胞取出，迅速在37T水浴中復(fù)蘇，然后轉(zhuǎn)入無菌室進(jìn)行細(xì)胞傳代。復(fù)蘇的MDBK細(xì)胞接種至含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、30昭/也慶大霉素的MEM培養(yǎng)基中，37Y、5%CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)23d至單層細(xì)胞時進(jìn)行連續(xù)傳代,至適宜代次后,可進(jìn)行病毒接種傳代操作。1.2.1 疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的制備將保存的疫

7、苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZO5-3,種毒稀釋后以0.01-0.001MOI接種單層MDBK細(xì)胞，加入含有2%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、30Mg/mL慶大霉素的MEM維持液中，轉(zhuǎn)入37幻、5%C%培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)80%-90%細(xì)胞病變時，-20Y反復(fù)凍融3次，收獲病毒液同時取樣測定毒價。然后將病毒液凍存于-20T：oBVDV二價活疫苗試制根據(jù)BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3病毒液的毒價和最小免疫劑量,用維持液稀釋病毒液至疫苗制備所需毒價，分裝后-20Y冷凍保存。1.2.2 BVDV二價活疫苗檢驗(yàn)按照生物制品檢驗(yàn)規(guī)程對試制的BVDV二價活疫苗的物理性狀、無菌和支原體檢驗(yàn)、安全

8、檢驗(yàn)、免疫原性檢測進(jìn)行檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1 MDBK細(xì)胞傳代培養(yǎng)MDBK細(xì)胞接種至含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、30妃也慶大霉素的MEM培養(yǎng)基中，37Y、5%CO2培養(yǎng)23d時可形成單層細(xì)胞,顯微鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)為梭形，細(xì)胞界限明顯。2.2 疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的制備疫苗毒BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3的最佳制備條件是種毒稀釋后以0.01-0.001MOI接種單層MDBK細(xì)胞，加入含有2%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、3（WmL慶大霉素的MEM維持液中，轉(zhuǎn)入37T、5%COz培養(yǎng)。35d出現(xiàn)80%90%細(xì)胞病變，-20幻反復(fù)凍融3次，取樣測定毒價。疫苗毒BVDV

9、2/JZO5-1和BVDV1/JZ05-3的毒價分別是1078TdD5o/mL和1076TCIDjo/niLoBVDV二價活疫苗試制制備的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3病毒原液分別用細(xì)胞維持液稀釋至1054TCID5o/mL和1056TCID5o/mL,分裝后-20T冷凍保存。2.3 BVDV二價活疫苗的檢驗(yàn)經(jīng)檢驗(yàn)，試制的5個批次的疫苗物理性狀正常，無菌和支原體檢驗(yàn)均未檢出，安全檢驗(yàn)結(jié)果安全，免疫28d平均血清中和抗體滴度lofeSNso均在7.0以上。檢驗(yàn)結(jié)果顯示試制的5個批次的BVDV二價弱毒活疫苗均能達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，結(jié)果見表lo表1BVDV二價活疫苗檢驗(yàn)結(jié)果Tabl

10、e1TheresultsofliveBVDVvaccine疫苗Vaccine批次lx)tno.物理性狀Physicalcharacter無菌和支原體檢驗(yàn)Sterileandmycoplasmatest安全檢驗(yàn)Safetytest免疫28d平均血清中和抗體滴度(loftSN«)Neutralizingantibodytiterinsenunafter28daysofimmunizationBVDV2/JZD5-1+BVDV1/JZ05-3SCII-1正常Normal合格Qualified安全Safety7.87.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3sen-2正常Norm

11、al合格Qualified安全Safely7.37.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3sell-3正常Normal合格Qualified安全Safety7.87.8BVDV2/JZO5-1+BVDVI/JZO5-3sen-4正常NormaJ合格Qualified安全Safety8.08.3BVDV2/JZO5-1+BVDV1/JZ05-3SCll-5正常Normal合格QualiGed安全Safety7.38.0（下轉(zhuǎn)第18頁）18處理均表現(xiàn)為催根期生根條數(shù)多、根鮮重高、出圃苗木根系多、苗蔓成熟度高、苗木質(zhì)量優(yōu)于其它試驗(yàn)處理。通過試驗(yàn)篩選出了“雪蘭紅”硬枝抨插適宜的生根劑：票

12、乙酸150mg/kg或n引噪酸150mg/kg,浸泡插條基部5cm處6h?？稍谏a(chǎn)中應(yīng)用。3.2試驗(yàn)中觀察到，“雪蘭紅”芽眼萌發(fā)的生物學(xué)溫度低，在5Y以上時芽眼即可萌發(fā)，在塑料大棚或溫室內(nèi)進(jìn)行硬枝抖插育苗，催根期間棚內(nèi)氣溫很難控制，氣溫過高會導(dǎo)致插條芽眼先萌發(fā)、展葉抽梢未生根、耗盡插條內(nèi)的貯藏營養(yǎng)后死亡。因此，“雪蘭紅”硬枝撲插育苗必須在育苗的頭1年的秋季在室外修筑回龍火炕或電熱溫床(電熱溫床用電量大，費(fèi)用大幅度高于回龍火炕)。3.3“雪蘭紅”硬枝抨插育苗技術(shù)復(fù)雜，每個技術(shù)環(huán)節(jié)的操作要認(rèn)真細(xì)致，例如插條和生根劑的質(zhì)量、催根火炕是否好燒、炕床溫度是否均衡、溫濕度控制、苗圃地管理等，否則會導(dǎo)致育苗

13、失敗。參考文獻(xiàn)1 宋潤剛.中國山葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展及對策J.中外葡萄與菊萄酒,2009,(3):33-35.2 宋潤剛，路文鵬，張慶等.釀酒葡萄新品種'雪蘭紅'J.園藝學(xué)報,2012,39(11):2312-2314.3 范書田.楊義明,劉景寬，等.生根粉和荼乙酸對左優(yōu)紅硬枝撲插生根的效果J.特產(chǎn)研究,2008,(2):42-43.4宋潤剛，路文鵬,沈育杰，等.山葡萄品種硬枝抨插生根研究J.中國果樹,2001,(】)：47.5宋潤剛，張慶田,劉景寬，等.不同種類生根劑對葡萄品種“北冰紅”硬枝抒插生根成苗效果的研究J.北方園藝,2009,(11):86-89.(上接第2頁)3討論BVD

14、V疫苗自出現(xiàn)以來，被USDA認(rèn)證用于商業(yè)化生產(chǎn)的已超過160種，這些疫苗有BVDV單價苗，也有BVDV與BHV-1、PI-3、IBR和Pasturella的聯(lián)苗。BVDV疫苗的制劑類型主要有滅活疫苗、改良活疫苗(Modifiedlivevaccine,MLV)和基因工程疫苗。BVDV-1型和BVDV-2型的混合疫苗國外的很多公司已有商業(yè)化的產(chǎn)品。Dean和Leyh在1999年通過對BVDV-1型WRL株改良活疫苗對BVDV-2型毒株的交叉免疫和交叉保護(hù)的研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度上能使牛產(chǎn)生BVDV-1型和BVDV-2型抗體，并維持相對較長的時間。Ridpath也在2005年做了類似的研究，但是抗體

15、的中和滴度差別較大。本研究利用已分離保存的BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒株，進(jìn)行合理配比制備出BVDV二價弱毒活疫苗。對試制的5個批次的疫苗進(jìn)行了物理性狀、無菌和支原體檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和免疫28d平均血清中和抗體滴度方面檢驗(yàn)，結(jié)果顯示物理性狀正常，未檢出細(xì)菌和支原體,安全檢驗(yàn)結(jié)果安全，免疫28d平均血清中和抗體滴度lofeSNjo均在7.0以上。檢驗(yàn)結(jié)果顯示試制的5個批次的BVDV二價弱毒活疫苗均能達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。為工業(yè)化生產(chǎn)BVDV二價弱毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1JReichelMP,HillH,VogesH.DoesControlofBovineVviralD

16、iarrhoeaInfectionMakeEconomicSsense?J.NewZealandVetJ,2008,56(2):60-66.201afsonP,MacCallumAD,FoxFH.AnApparentlyNewTransmissibleDiseaseofCattleJ.CornellVet,1946,36:205-213.3】牛病毒性腹瀉BVDV2/JZ05-1活疫苗最小免疫劑量及攻毒保護(hù)試驗(yàn)J.特產(chǎn)研究,2012,(4):8-9.4 牛病毒性腹瀉BVDV2/JZ05-1基礎(chǔ)毒株的安全性和免疫原性研究J.特產(chǎn)研究,2012,：5-8.5 IizzagoC,BandiC,BronzoV,etal.DistributionPatternofBovineViralDiarrheaVimsStrainsinIntensiveCattleHerdsinItalyJ.VetMicrobiolgy,2001,83:265-274.6RidpathJF.PracticalSignificanceofHete