甘肅省健康豬群豬鏈球菌分離株的耐藥性檢測.docxVIP

1、文章編號1001-3601（2011）02-0108-0128-03甘肅省健康豬群豬鏈球菌分離株的耐藥性檢測邢娟微，李學瑞之，柳紀省,胡永浩I（】.It肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院.甘甫蘭州730070,2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州料醫(yī)研究所，甘甫蘭州730046）摘要為了解甘肅地區(qū)表觀健康豬群攜帶豬群豬鏈球菌的情況，從甘肅省武威、蘭州、慶陽等地采集到152份健康豬扁桃體分離豬鏈球藺，結(jié)果共分離到67株.分離率約44%,67株豬鏈球菌的射藥性檢測表明，全部豬鏈球茵分離株具有多重耐藥性.其中1株對22種抗生素中的16種產(chǎn)生耐藥性。用我國致病性鏈球茵2型特有的89k毒力島序列特異性引物對67株豬鏈球菌進行PCR

2、簽定，其中1株能夠擴增出該特異性片段，表明在該地區(qū)健康豬群中存在致病性2型豬鏈球苗。關(guān)鍵詞豬鏈球菌；藥敏試驗；毒力島中圖分類號S852.6P1文獻標識碼ADrugToleranceof67StreptococcussuisStrainsIsolatedfromHealthyPigsinGansuProvinceXINGJuan12,LIXue-rui2,LIUJi-xing2HUYong-hao1(.1.CollegeofAnimalMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou.Gansu730070；2.LanzhouVeterinaryResea

3、rchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,iMnzhouGansu730046.China)Abstract：Thedrugtoleranceof67S.suisstrainsisolatedfromtonsilof152healthypigswasdetectedtoknowthestatusofapparenthealthypigscarryingS.suisinGansuprovince.TheresultsshowedthatallisolatedS.suisstrainswereofmulti-drugtoleranceand

4、anisolatedstrainwasofdrugtoleranceto16antibioticsof22antibiotics.Thespecific89kpathogenicityislandsequencespecificityprimerofChinesepathogenicityIJS.suiscouldbeamplifiedfromanisolatedstrain,whichindicatesthatthereispathogenicityIIS.suisinGansuprovince.Keywords:S.suisidrugsensitivetest；pathogenicityi

5、sland豬鏈球菌?。⊿treptococosis）是一種分布范圍極廣的由豬鏈球Streptococcussuis（.S.5uis）感染所引起的一類豬疾病的總稱。豬鏈球菌（S.SMis）是革蘭氏陽性兼性厭軻的球菌，目前已知有35個血清型（但也有研究認為鏈球菌32型和34型屬于Streptococcus,Orisratti）其中2型致病力最強、分布最廣泛。該南可引起豬腦膜炎、肺炎等病癥，嚴重者死亡；也可感染人，引起人敗血癥、心內(nèi)膜炎等癥狀.甚至死亡。1990年，1998年和2005年，在我國廣東、江蘇和四川省部分地區(qū)暴發(fā)豬鏈球菌感染人的疫情，均引起人員死亡口司。因此.防治豬鏈球菌病具有重要的經(jīng)濟

6、和社會意義。但近年來，由于抗生素的濫用，特別是在動物飼料中添加抗生素及在疾病治療過程中抗生素的不當使月J.使得細倒的耐藥菌株越來越多，其耐藥譜逐年變化，日趨嚴塞句,從而使抗生素的治療效果降低。如果讓豬鏈球倒耐藥性不斷增加，難免產(chǎn)生耐藥性的超級豬鏈球前，由此類細菌所引發(fā)的疫病-旦爆發(fā)，將難以控制。近年來.國外研究者對豬鏈球菌健康豬群所攜帶的豬鏈球菌分離株的耐藥性以及菌群的分類進行了研究匚但有關(guān)豬鏈球筋的研究在國內(nèi)較少。任肅省是一個畜牧業(yè)比重較大的省份，到目前為止，尚未見豬鏈球菌大規(guī)模爆發(fā)的報道或人感染豬鏈球菌而致死亡的報道。作者等以表觀健康豬為研究對象.從甘肅省武威、蘭州、慶陽等地收集屠宰豬的扁

7、桃體，從豬扁桃體部位分離豬鏈球菌株.采用藥敏紙片擴散法對各豬鏈球菌窗株進行耐藥性測定，分析豬鏈球菌的耐藥狀況；同時.利用我國豬鏈球菌2型的一個89k疑似毒力島序列，進行特異性擴增.以監(jiān)測甘肅省表觀健康豬群中是否存在豬鏈球薄2型致病毒株，以期為豬鏈球曲的臨床防治提供依據(jù)。1 材料與方法1.1材料參考萌株購自中國獸藥監(jiān)察所。試驗菌株152份，分離自甘肅省慶陽、蘭州、武威等地區(qū)（從豬扁桃體部位分離）。藥敏紙片22種.為鏈容素、桿菌肽、四環(huán)素、先鋒卷素V、育霉素、紅毒素、氯潔霉素、潔霉素、氨節(jié)青霉素、瓶哌酸、苯嗤育霉素、萬古霉索、阿莫西林、慶大霉素、阿奇霉素、強力鋌素、恩諾沙星、羅紅花素、克拉霉素、卡

8、那霉素、氯霉素和利福收稿日期2010-11-05|2011-0103修網(wǎng)基金項目甘南省科技衣大專頊“外源營養(yǎng)依賴型掰2型鏈球茵分子疫苗的研究M（0801NKDA035>作者簡介邢姐1983）.女.在讀碩士.研究方向：維防魯醫(yī)學.滴訊作名、柳ft!?。?955）.男.研究員.從事病擊及細萌病的防治研究.Email.liujixinR（引物序號引物序列擴增片段長度/kbPrimerNo.PrimersequenceLength15,-CACGCATCTCGTAGAGTTTGAC-3*1.8（1和2）25'-AGATTGCGAGOCTTTTAGATTG-3Z35'-TCGCCA

9、CTATGGTATCTGCTTA31.0（3和4）45'-GATTGTGGACCATGCTGTTTAG-3Z55'-ATAAATAGCCCCATCCTCATCA-3,0.7（5和6）65'-GCGTAGCTGCTTAGTGCTACAA3'1.5（1和6）與89k«力島相關(guān)的引物Table1Theprimersrelatedto89kpathogenicityisland表267株豬鏈球菌的藥敏試驗結(jié)果平，均購于杭州微生物試劑有限公司。THB培養(yǎng)基自制。1.2方法細茵分高及生化鑒定無前采取豬扁桃體(0.5g左右)至THB培養(yǎng)液中，37C培養(yǎng)16h后涂片，

10、進行革蘭氏染色鏡檢，將鏡檢時存在有鏈球菌的培養(yǎng)物接種于THB瓊脂平板，37C培養(yǎng)18h,挑取單個菌落，涂片染色鏡檢，確定為鏈球曲后接種于THB瓊脂平板。將分離菌株分別進行生化鑒定，確定為豬鏈球菌者，置4C冰箱備用。1.2.1 藥敏試驗采用藥敏紙片擴散法，按常規(guī)方法即挑取豬鏈球菌單個菌落密集均勻地涂布整個平板，將含有抗生素藥物的濾紙片用燒灼滅萌的鍛子分別貼于平板表面，相互間應間隔一定距離，37C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。判定標準：按抑萌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準，抑菌圈直徑在15mm以上為高度敏感，1015mm為中度敏感，10mm以下為低度敏感，無抑削圈的為不敏感。敏感率/%=(高敏帶株數(shù)+

11、中敏萌株數(shù))/菌株總數(shù)X100高敏率/%=高敏菌株數(shù)/菌株總數(shù)X100耐藥率/%=耐藥菌株/萌株總數(shù)JX1001.2.2 豬鏈球菌基因組DNA的提取根據(jù)改良的TELT法提取豬鏈球菌基因組DNA。挑取豬鏈球函單菌落，接種于TH培養(yǎng)液中，37C培養(yǎng)過夜。取2mL細萌培養(yǎng)物于離心管中，10000g離心1min,棄上清液，在沉淀中加入TELT細菌裂解液表1(50mmol/LTris、pH8.5,62.5mmol/LED】A、pH8.5,2.5mol/LLiCl,1%TritonX-100)500ML,混勻，室溫放置3min后加入500ML:氯仿：異戊僧(25:24:l,v/v),混勻。10000g離心

12、5min,取上清液.加入等體積的貌仿溶液，輕輕搖勻。10000g再離心5min,取上清液，再加入等體積的氯仿溶液.輕輕搖勻J0000g離心lmin,取上清液.加入2倍體積的純乙醇沉淀DNA。于4C、12000g離心30min,棄乙博，保留沉淀，用70%乙醇再清洗2次，棄液體，沉淀于室溫晾干，加入滅曲水溶解基因組DNA60尸置4C冰箱備用。1.2.4與豬鏈球菌2型相關(guān)的豬鏈球菌毒力島基因的擴增參照ChenC等研究中所用的引物,89k毒力島的相關(guān)引物見表1。2 結(jié)果與分析豬鏈球菌菌株的分離從152份健康豬扁桃體中共分離出豬鏈球俏67株，其中武威地區(qū)26/40(65%),慶陽地區(qū)30/72(41.6

13、%),蘭州地區(qū)11/40(27.5%),總的豬鏈球曲分離率約為44%。2.1 藥敏試驗由表2可看出，先鋒零素V、青零素、氨節(jié)青零素、萬古霉素和阿莫西林對分離的豬鏈球菌菌株作用強，高度敏感株可達80.6%100%；紅毒素、氟哌酸、阿奇霉素、恩諾沙星、羅紅錐素、克拉德素、氯霉素和利福平作用次之，高度敏感株達53.7%73.2%。分離的豬鏈球陶對鏈農(nóng)素、桿菌肽和四環(huán)素Table2Thedrugsensitivityof67isolatedStrefilococcussuisstrains抗生素Antibiotic高度敏感Extremelysensitivity比例/%中度敏感Mediumsensit

14、ivity_比例/以料藥Drugtolerance島度敏感ExtremelysensitiveStrainProportionStrainProportionStrainProportion抗生素Antibiotic株數(shù)比例/%株數(shù)比例/%StrainProportion中度敏感Mediumsensitivitylift比例/%耐藥Drugresistance株數(shù)比例/%StrainProportionStrainProportion索素素素卷待素肽索每素素毒素奇酸育待菌環(huán)鋒需霉?jié)嵜縭哌哇鏈桿四先肓紅M潔基M笨01553188579&3.62O7.4.4.2.11256 oo.o908

15、n993.O.O2292742O3.L5.O9.8.2ii萬阿慶阿強恩非克卡敘利素林*素索星素素*一霉西福莓布沙«布布素平4494949492714183087399444894O0O066564.LO322121411抗生素/抻Antibiotic圖167株豬鏈球董的多重耐藥情況Fig.1Multi-drugtoleranceof67isolatedStreptococcussuisstrainsMMM2000bp1000bp引物I和2擴域產(chǎn)物引物3和4擴增產(chǎn)物引物5和6擴增產(chǎn)物2000bp1000bp750bpPCRproductsofIand2PCRproductsof3and

16、4primerPCRproductsof5and6primer1：PCR產(chǎn)物；M：DL2000DNAMarker的耐藥率達80.6%100%,對氯潔霉素、潔霉素和苯哩青霉素的耐藥率達58.2%65.7%。2.367株豬鏈球菌的多重耐藥情況由圖1可見，多數(shù)受檢菌株均對2種以抗生素具有耐藥性，并目.沒有菌株為全部抗生素敏感株。2.4豬鏈球菌分離株中致病毒株的PCR檢測經(jīng)PCR檢測，僅在1株豬鏈球菌中檢測到疑似毒力島序列(圖2),表明，在甘肅省健康豬群中存在致病性2型豬鏈球菌。1:PCRproducts；M：DL2000DNAMarker圖289k毒力島擴增產(chǎn)物Fig.2Amplificationp

17、roductsof89kpathogenicityisland3 小結(jié)與討論Davies等研究表明，豬鏈球曲2型在健康豬扁桃體內(nèi)的帶菌率高達76%。Sandy等:厄研究表明，豬鏈球菌在健康豬扁桃體內(nèi)的帶偏率甚至高達100%。本研究從152個健康豬扁桃體中分離出豬鏈球悟67株，分離率約44%,遠低于Davies等，Sandy等的研究結(jié)果，但與InmacLadaLuque8在西班牙的研究(28.2%)高16百分點左右，說明，甘甫省慶陽、蘭州、武威等地區(qū)健康豬扁桃體中豬鏈球菌帶菌率相對較高。近年來，在豬鏈球菌病的防治過程中，盲目使用一些抗萌藥物，導致耐藥菌株越來越多，并日趨嚴重。藥敏試驗結(jié)果表明，所

18、分離的67株豬鏈球菌對先鋒零索V、青霉素、氨苯青毒素、萬古輯索4種抗生素高度敏感，但是全部菌株對2種以上抗生素具有耐藥性.與我國忒他學者在東北、河南等地對豬鋌球菌耐藥菌株所作的耐藥性研究相符研究中，耐藥性最嚴重的1株竟對22種抗生素中的16種抗生素產(chǎn)生多重耐藥性.提示人們應密切關(guān)注豬鏈球菌耐藥性的嚴重程度.正確應用先鋒需索V、青卷素、氛乍青霉素、萬古很素等抗生素，以免豬鏈球菌對上述抗生素也產(chǎn)生耐藥性，從而影響豬鏈球萌病發(fā)生時對該病的有效防治。ChenC等】研究發(fā)現(xiàn)，我國現(xiàn)有的致病性2型豬鏈球菌菌株均含有1個89k的疑似卷力島序列.并給出了該毒力島序列特異性擴增引物，4對引物中，引物1和6所能擴

19、增出1.5kb的片段，目前僅在歐洲菌株中能擴增出，而在我國所存在的菌株中均未擴出。研究利用其特異性引物對所分離的67株豬疑球菌進行PCR鑒定，僅發(fā)現(xiàn)1株分離株能夠擴增出毒力島特異性片段。說明，甘甫省健康豬群存在致病性豬2型鏈球菌御株，應密切關(guān)注未來該地區(qū)豬鏈球南的發(fā)病情況。參考文獻13蔡寶祥.家畜傳染病學M.2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社1991:141-144.2TouilF,HigginR,NadeauM.AisolationofStreptococcussuisfromdiseasedpigsinCanadaJVetMicrobiol,1988,17：171-177.3 系寶祥.家畜傳染病學

20、CM.2版.北京，農(nóng)業(yè)出版社，1991J86-190.4 黃靜.張?zhí)K強.豬溶血性鏈球萌診療報告J.中國獸醫(yī)雜志,1992,18(1):22-23.5 物演，盧中華，張紅英，等.豬鏈球曲病病原的生化分群鑒定和藥敏試驗J.中國畜牧獸醫(yī)，2004.31(4):32-33.6 鄭世軍.楊漢春.豬病免疫與防治技術(shù)M.北京：北京農(nóng)業(yè)大學出版社.1995.7JSlaatsJ.Feder!,Okwumabua(),etal.StreptococcuussuisPastandPreasent_J.VetResCommun,1997.21(6):381-407.文章編號J1OO1-36OK2O11)02-0109

21、-0131-04安徽地方豬種質(zhì)資源及其特性與開發(fā)利用殷宗俊(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230036)摘要為安徽省地方豬的保種及利用提供科學依據(jù)，對安徽省地方豬的種質(zhì)資源及其有關(guān)特，性進行了調(diào)查。結(jié)果表明：安徽地方豬種具有繁殖力高、肉質(zhì)好等優(yōu)點，但存在純種數(shù)量少、生長慢、瘦肉率相對較低等劣勢。同時分析了安徽省地方豬保種工作存在的問題，并提出了對現(xiàn)有豬種資源的保護及開發(fā)利用措施關(guān)鍵詞地方豬；遺傳資源；評估；開發(fā)利用中圖分類號S828.9文獻標識碼AAnhuiNativePigResourse,CharacteristicandItsExploitationandUtilizationYIN

22、Zong-jun(CollegeofAnimalScienceandTechnology.AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036.China)Abstract：TheresourcesandcharacteristicsofAnhuinativepigwereinvestigatedtoprovideascientificbasisforprotectionandexploitationofAnhuinativepig.Theresultsshowedthatthequantityofpurebredpigsissmall,whichhave

23、highreproductivecapacityandhighmeatqualityaswellasthedeficienciesofslow-growingandlowerleanpercentage.Theproblemsandsomemeasuresofprotectionandexploitationforexistingpigresourceswereproposedinthispaper.Keywords:nativepig;geneticresources；evaluation；exploitationandutilization安徽省地處長江中下游，季風明顯，四季分明，由北向南

24、可劃分為淮北平原、江淮丘陵、沿江平原、皖南山區(qū)四大類型生態(tài)區(qū)域。由于各大生態(tài)區(qū)環(huán)境的復雜多樣、南北跨度大及海拔高度懸殊，從而形成了不同的生態(tài)條件和與其相適應的畜禽種質(zhì)資源。根據(jù)生態(tài)類型特點安徽省地方豬種分為皖北豬、淮南豬(定遠豬、壽旅黑豬)、皖南花豬、皖南黑豬、安慶六白豬、機陽黑貓、好貓等，這些地方豬種均有著繁殖力高、抗逆性強、肉質(zhì)優(yōu)良且對肯粗料利用率高等優(yōu)良特征C，5).然而，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，市場對高瘦肉率豬肉的需求增加.加之品種改良工作的深入，致使安徽省地方豬種資源呈現(xiàn)急劇減少的態(tài)勢，有些品種甚至絕種或已瀕臨絕種。如果這種情況繼續(xù)下去，許多優(yōu)秀基因在我們尚未認識其價

25、值之前就永遠從豬基因庫中消失。因此，為了保護安徽省地方豬的種質(zhì)資源，就必須了解地方豬的遺傳多樣性狀況.加強對地方豬種種質(zhì)資源的合理保護和開發(fā)利用。這不僅是發(fā)展當前經(jīng)濟，造福未來的需要，而且其成功的經(jīng)驗對于安徽省乃至我國豬種遺傳資源的保存均具有重大的指導意義。鑒于此，筆者就安徽省地方豬的種類及品種特征進行概述，并針對目前安徽省地方豬保護工作中存在的問題提出了針對性的措施，旨在為安徽省地方豬的保種及利用提供科學依據(jù)。收稿日期201010-18；2010-12-21修回基金項目安微省“十一五”科技攻關(guān)頁點項目“優(yōu)質(zhì)高繁殖力瘦肉型坪豬新品系培育及其配套組裝"(07010302136)作者笥介股宗ft(1967),男教授.博士.從