新甲型H1N1流感和季節(jié)性流感臨床快速診斷的研究.docx

1、新甲型H1N1流感和季節(jié)性流感臨床快速診斷的研究程曉東。袁權。蘇明權】，張榮，馬越云，陳毅歆夏寧邵郝曉柯'(1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學中心，西安710032；2.廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建廈門361005)摘要：目的考核北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產的甲型流感病毒抗原檢測試劑(斑點ELISA)的臨床應用效果。方法選用BD公司的DirectigenEZFluA+B流感檢測試劑作為對照試劑，并以實時熒光RT-PCR結果為標準，進行比對試驗。結果萬泰試劑對于64份新甲型H1N1流感病毒的檢測敏感度達92.2%,對季節(jié)性流感患者的檢測敏感度為91.1%。

2、特異度為99.8%°作為對照，BD試劑檢測新甲型流感病毒的敏感度為78.1%,明顯低于萬泰試劑(尸=0.016)。結論萬泰斑點ELISA試劑對于新甲型H1N1流感和季節(jié)牲流感的檢測靈敏度都超過90%,同時具有很好的特異度，顯示了其在臨床使用中的巨大潛力。關鍵詞：新甲型H1N1流感；甲流抗原斑點檢測試劑；逆轉錄聚合酶鏈反應中圖分類號：R373.1+3;R446.62文獻標志碼：A文章編號：1671-7414(2010)03-061-04doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2010.03.019SensitiveRapidAntigenTestfortheClini

3、calDiagnosisof2009PandemicA/H1N1andSeasonalInfluenzaACHENGXiao-dong1,YUANQuan2,SUMing-quan1,ZHANGRong1,MAYue-yun1,CHENYi-xin2,XIANing-shao29HAOXiao-ke1(1.CenterofClinicalMolecularBiology9XijingHospital9theFourthMilitaryMedicalUniversity9Xiyan710032tCAzna;2.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDev

4、elopmentinInfectiousDisease9XiamenUniversity9FujianXiamen361005China)Abstract:ObjectiveToinvestigatetheclinicalapplicationofWantaiFlu-ADot-ELISA.MethodsAnevaluationofperformanceofanewlydevelopedRIDTtestcomparedwithBDDirectigenEZFluA+BandRT-Realtime-PCRwasconductedwithregardstotheclinicaldiagnosisofp

5、andemicA/H1N1andseasonalinfluenzaAinfection.ResultsFoundFlu-ADot-ELISAyieldedasensitivityof92.2%among64pandemicA/H1N1patientsand91.1%amongseasonalinfluenzaApatientswithaspecificityof997%Thecontrols,pandemicA/H1N1specimenstestedbyBDDirectigenEZFluA+Byieldedasensitivityof78.1%whichwassignificantlylowe

6、rthanFluADot(P=0.016).ConclusionWantaiFlu-ADot-ELISAyieldedasensitivityofover90%bothinpandemicA/H1N1patientsandseasonalinfluenzaApatientswithgoodspecificity.Theseencouragingresultshighlightitspotentialuseintheclinic.Keywords：2009PandemicA/H1N1；FluA-Ag,DotELISA»reverse-transcriptasepolymerasecha

7、inreaction目前，流感病毒診斷的金標準是病毒培養(yǎng)。其他檢測技術包括應用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse-transcriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR)進行的核酸檢測等。與病毒培養(yǎng)相比,RT-PCR明顯縮短了出報告的時間，并且具有更好2009年3月底4月初，一種新型的豬起源甲類流行性感冒病毒(2009PandemicA/H1N1)出現(xiàn)在墨西哥和美國。2009年4月30日凌晨，世界衛(wèi)生組織把全球流感大流行警告級別提高到第5級。6月11日，WH()又宣布將甲型H1N1流感大流行警告級別提升為6級，全球進入流感大流行階段。截至2009年12月20日，

8、超過208個國家報告了病例，并且已經造成了超過11516人死亡。該病毒的蔓延越發(fā)突顯了擁有良好診斷信息的重要性。的敏感性。但是RT-PCR(包括實時熒光RT-PCR)費用昂貴，操作人員需要受過專業(yè)培訓，而且進行批量的處理實驗，費時費力。因此快速流感診斷實驗以快速的出報告時間(1030min)和較低的運行成本已成為一個床旁診斷流感病毒的有利工具。前期的研究顯示當前的快檢試劑大多是基于免疫層析法原理，他們的敏感性大部分只能達到11%79%之問35】。這種情況很不理想并急需改善，因此我們在新甲型H1N1流感和季節(jié)性流感大流行期間，應用萬泰斑點ELISA檢測試劑與美國BD公司的流感病毒抗原快速篩查試劑

9、DirectigenEZFluA+B同時進行臨床檢測，并以實時熒光RT-PCR結果作為標準，比較該試劑的敏感度和特異度。.1材料和方法作者簡介：程曉東(1972),男，碩士研究生，研究方向：分子微生物學»E-mail：xjyyjyk。通訊作者：都曉柯，E-mail：haoxkgo1.1實驗材料1.1.120株A型流感病毒毒株（10株為2009年A型/H1N1新甲流株，5株H3N2季節(jié)性和5株H1N1季節(jié)性流感病毒株）和三種全長重組核蛋白rHlnp,rH3np和rSOIVnpC濃度均為2ng/ml）,以上樣品均為廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心惠贈，用于試劑敏感度試驗。

10、1. 1.2收集2009年9月24日26日，共807例西京醫(yī)院發(fā)熱門診的發(fā)燒患者（38C以上）的鼻咽拭子標本。病人的年齡6個月86歲，其中男性患者436例，女性患者371例，大部分為在校學生。鼻咽拭子標本采集后，存儲在15ml病毒保存液中，用于快速抗原檢測和核酸檢測。1.1.3兩種快速檢測試劑：實驗試劑為北京萬泰公司的FluA抗原斑點ELISA試劑，檢測樣品中的病毒核蛋白抗原（FluANP）,對照試劑為BD公司DirectigenEZFluA+B檢測試劑，兩種試劑檢測均嚴格按操作執(zhí)行。1.2實驗，方法1-2.1病毒培養(yǎng)：以MDCK細胞培養(yǎng)甲型流感病毒，當75%100%細胞出現(xiàn)病變時進行收獲上清

11、，以豚鼠紅細胞進行凝集試驗（HA）鑒定病毒生長情況，并進行甲流的血清學分型，置一80C保存。1.2.2病毒抗原檢測：使用上述兩種試劑，并嚴格按操作指南進行。1.2.3病毒RNA的提取：樣本量200使用商品化核酸提取試劑（廈門百維信），在Biomek%IX全自動核酸提取儀（貝克曼庫爾特）上執(zhí)行。新甲型H1N1病毒核酸檢測首先使用達安基因公司試劑進行RealtimeRT-PCR法，陽性標本被診斷為感染新甲型H1N1流感病毒。陰性標本加做CDC推薦的RealtimeRT-PCR以排除可能的遺漏和季節(jié)性流感的感染。1. 3統(tǒng)計學分析采用X2檢驗和Fisher精確檢驗進行統(tǒng)計分析。P值0.05,則說明二

12、者存在顯著性差異。本研究獲得西京醫(yī)院倫理委員會的批準。2結果120株A型流感病毒毒株經MDCK細胞培養(yǎng)結果見圖1。以豚鼠紅細胞凝集試驗（HA）鑒定其滴度均大于8HA單位/ml。2.2試劑靈敏度試驗A（A,病毒培養(yǎng)前細胞;病毒培養(yǎng)后細胞）圖1MDCK細胞病毒培養(yǎng)2. 2.1三種重組的NP蛋白經連續(xù)的倍比稀釋從2ng/ml。.016ng/ml（稀釋了2,倍），然后分別用兩種試劑進行測定。萬泰試劑的最低檢測濃度都是0.063ng/ml,而BD試劑對于rHlnp,rH3np和rSOIVnp的最低檢測濃度分別是1,2ng/ml及2ng/mlo2.2.220株經培養(yǎng)的甲型流行性感冒病毒株用20g/dl的P

13、BS稀釋成0.1HA單位/ml,然后連續(xù)倍比稀釋到0.00005HA單位/ml（稀釋了2”倍）。這些稀釋的樣品同時進行二種試劑及CDC推薦的RT-realtime-PCR檢測。最少能檢出50%的所有病毒株的HA稀釋度規(guī)定為分析檢測下限。因此,三種方法的分析檢測下限分別是CDCRT-reaktime-PCR：0.0001HA單位/ml,萬泰試劑：0.0008HA單位/ml,BD試劑：0.0125HA單位/ml。由于萬泰試劑比BD試劑靈敏度高16倍，因此選定其對臨床標本做進一步檢測。2.2.3在807名發(fā)熱患者中，經RT-PCR檢測出166例季節(jié)性流感，64例新甲型H1N1流感，其余577例患者沒

14、有感染流感病毒。在新甲型H1N1流感患者、季節(jié)性流感患者和非流感患者當中，經萬泰試劑檢測為陽性的分別是59例，151例和2例（表1）。作為對照，用BD試劑檢測這64份新甲流標本，其敏感度為78.1%（5O/64,95%CI：66.O87.5）,明顯低于FluADot的結果（P=）.016）。3討論流感的快速診斷是非常有用的，因為它能適當降低抗生素的使用情況，并能指導醫(yī)生恰當?shù)氖褂每共《舅幬?，達到最終減少病人花費的目的。不過，當前大部分使用的流感快速測試都表現(xiàn)的不盡如人意。Vasoo等最近已報告三種全球范圍內使用的快檢試劑對于此次的新甲型H1N1流感的檢出率分別是46.7%,38.3%和53.3

15、%。在Drexler等的研究顯示Binaxnow流感A&B試劑對于144例PCR陽性鼻拭子及咽喉樣本的敏感度只有U%。Welch等報告了在2009年春季第一波新甲型H1N1流感病毒發(fā)作期間，使用BD公司試劑測定了經LuminexxTAGRVP試劑和美國疾病控制及預防中心PCR檢測鑒定的1599例患者,結果敏感度為77%。還有一些快檢試劑對新甲型H1N1流感的檢測敏感度與對季節(jié)性流感的檢測敏感度相比明顯下降（53.4%比74.2%,P<0.01）“J,這可能與核蛋白的抗原性差異有關，或者與流感病毒來自呼吸道不同部位的脫落細胞有關口°?？傊郧暗牧鞲锌鞕z試劑不適合于臨床診

16、斷的需要口訂。表1快速診斷試劑臨床性能分析（萬泰FluADot）項目新甲型H1N1季節(jié)性流感非流感合計RT-PCR64(8%)166(21%)577(71.2%)807(100%)軸（了七）12±3151151611315土7好(M/F)37/2784/M314/263434/373啪59(92.2%)151(91.1%)2(0.3%)212(26.3%)5(7.8%)15(8.9%)575(99.7%)595(73.7%)革勇度91.3%(CI：87.094.7)m99.8%(C【：99.0100)99.5%(CI；97.4100)96.6%(CI：94.997.9)用培養(yǎng)的病毒進

17、行分析靈敏度的測定可以間接反映檢測臨床患者感染相同流感病毒的臨床敏感度。結果顯示PCR高于萬泰試劑檢測限816倍，而萬泰試劑高于BD試劑檢測限16倍左右。這可能歸因于較高親和抗體的使用和方法學上的優(yōu)勢。在此項研究中的臨床標本絕大多數(shù)來自學齡前兒童和學生（年齡：222歲，=628,77.8%）。新甲型H1N1流感患者與季節(jié)性流感患者在年齡和性別比率方面沒有顯著差異（P=0.110,P=0.310,分別見表1）。萬泰試劑對于新甲型H1N1流感和季節(jié)性流感的檢測敏感度超過90%,同時具有很好的特異度。高臨床敏感度可能是由于兩個方面的原因：本身是很好的測試試劑；使用了高質量臨床標本。在本研究中，每個標

18、本都是用長柄棉拭子從患者后鼻咽處采集，而后鼻咽處的上皮細胞研究顯示更容易產生B待檢測抗原。但對于BD公司的試劑，對這64例新甲型H1N1患者中只檢出了78.1%,敏感度與Welch等*的報告類似但高于其他用喉嚨或鼻拭子的研究?？傊?，利用萬泰生產的斑點ELISA試劑檢測新甲型H1N和季節(jié)性流感病毒的敏感度達到90%以上。這種敏感快速流感診斷測試必然會在流感的診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。參考文獻：1 CentersforDiseaseControlandPrevention.SwineinfluenzaA(H1N1)infectionintwochildren-SouthernCalifornia

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25、nthepediatricemergencymedicinesettingbyuseofthreespecimencollectionmethodsJ.JClinMicrobiol,2006,44(7):2638-2641.收稿日期：2010-05-17修回日期：2010-05-19不同廠商真空采血管致BT-2000Plush生化分析儀“S”報警提示汪旭強，陶永東，賈小強（天水市第三人民醫(yī)院檢驗科，甘肅天水741000）中圖分類號*446文獻標志碼：B文章編號：1671-7414（2010）03-064-01doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2010.03.020工作中

26、發(fā)現(xiàn)BT-2000Plush生化分析儀對真空采血管中血清無法探測的報警提示出現(xiàn)頻繁，以“儀器故障”做檢查維修，結果發(fā)現(xiàn)，引起報警提示非儀器故障，而是由于不同廠商生產的真空采血管所導致，現(xiàn)報道如下，供同行參考。1材料與方法1.1儀器意大利BT-2000Plush生化分析儀。1.2 真空采血管國內兩廠商生產，筆者標注“A管”和“B管二方法將空白“A管”和空白“B管”分別放置于樣品盤孔位中并人為進行轉動，觀察儀器“真空采血管感應器”指示燈的變化。肉眼觀察比較空白“A管”和空白“B管，2結果2.1“真空采血管感應器”的變化空白“A管”隨意放置和轉動，“真空采血管感應器''指示燈均閃爍；

27、空白“B管”無標簽一側對著“真空采血管感應器”時，指示燈無閃爍，當有標簽一面對著“真空采血管感應器”時，指示燈均閃爍。2.2肉眼觀察比較空白“A管”通體無色透亮，外表面光滑，反光度強；空白“B管”管壁略帶淡黃色，外表面光滑度及反光度均差于空白“A管”。3討論BT-2000Plush生化分析儀的“樣品盤模塊”支持“真空采血管”和“樣品杯”兩種容器的檢測模式，對兩種容器的甄別，是依靠模塊中的“真空采血管感應器”該裝置的工作原理，是紅外線發(fā)射一束紅外光照射樣品盤，臨近的紅外線感應器接受樣品容器反射回的紅外線，若接受的紅外線，儀器判斷該容器為“真空采血管”，相反，若未接受到紅外線，儀器判斷該容器為“樣品杯根據這一判斷結果，儀器在吸取樣品時采取不同的運動方式：對“真空采管管”容器，吸樣針可下降到管底，可控測到最少1ml的液體；