新城疫病毒HN蛋白的抑瘤機(jī)制及其研究進(jìn)展.docx

1、第2】卷第3期2014年9月天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)JournalofTianjinAgriculturalUniversityVbl.21,No.3September,2014文章編號：1008-5394(2014)03-0049-04新城疫病毒HN蛋白的抑瘤機(jī)制及其研究誑展高靜2,董東曉】，龍雨清'，李萌'，李留安'，金天明15奢(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384：2.天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司，天津300384)摘要：新城疫病毒囊膜上較大的纖突樣糖蛋白由新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因編碼。HN蛋白即血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白，它不僅介導(dǎo)病毒吸附于腫

2、瘤細(xì)胞，而且與融合阪白一起幫助病毒侵入腫瘤細(xì)胞,其神經(jīng)氨酸酶活性能水解宿主細(xì)胞表面的唾液酸，暴露宿主細(xì)胞的生物識別位點(diǎn)。它還能夠水解病毒粒子表面糖鏈末端的唾液酸，防止病毒粒子在宿主表面簇集，并旦能夠引入新的粘附因子和免疫原性分子，誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)識別。關(guān)鍵詞：新城疫病毒；HN蛋白；抑瘤機(jī)制中圖分類號：S857.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：AAntitumorMechanismofNewcastleDiseaseVirusHNProteinandItsResearchProgressGAOJing1,2,DONGDong-xiao1,LONGYu-qing1,LIMeng1,LILiu-an1,JINTian

3、-ming1'頃心卬就灑小。(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.TianjinShengjiGroupLimitedCompany,Tianjin300384,China)Abstract:Thelargespike-likemembraneglycoproteinsfromtheNewcastlediseasevirusenvelopewereencodedbyNewcastlediseasevirushemagglutin

4、in-neuraminidase(HN)gene.HNproteinistheabbreviatedformofhemagglutinin-neuraminidaseprotein,itnotonlymediatesvirusadsorptionontumorcells,butalsomakesvirusinvadetumorcellswiththehelpofthefusionprotein,anditsneuraminidaseactivitycanhydrolyzesurfacesialicacidofthehostcellsandexposethebiologicalrecogniti

5、onsitesofhostcells.Itisalsoabletohydrolyzesialicacidlyingonsugarchainendofvirusparticlesurface,preventvirusparticlesfromclusteringonthehostsurface,furthermore,itcanintroducenewimmunogenicfactorsandadhesionmoleculestoinducetherecognitionofimmunesystems.Keywords:Newcastlediseasevirus;HNprotein;antitum

6、ormechanism收稿日期：2013-10-18基金項(xiàng)目：國家白然基金項(xiàng)目,TRAIL和H、基因重組腺病毒的構(gòu)建及其對禽白血病腫瘤細(xì)胞的抑制作用”(31072109);天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金項(xiàng)目“APPlS影載體豬巴氏桿弟基因疫苗的研究°(20060720);天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目“Ad-TRAIL-2A-HN的構(gòu)建及其對MD腫瘤細(xì)胞的抑制作用”(12JCZDJC22100)作者簡介：高伸(1982-),女，天津市人，工程師，碩士，研究方向?yàn)橹蝎F藥新藥研發(fā)及獸醫(yī)生物技術(shù)與疫苗。E-mail：gj090329。通信作者：金天明(1968-),男,內(nèi)蒙古通江人，教授，博上，主

7、要研究方向?yàn)榉肿用庖卟±韺W(xué)。E-mail：。自1990年人類首次進(jìn)行疾病的基因治療試驗(yàn)以來，基因療法作為一種全新的治療手段日益引起人們的重視，特別是對現(xiàn)在還不能使用傳統(tǒng)醫(yī)療手段徹底治愈的惡性腫瘤，基因治療已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢，其核心策略之一是通過基因重組等手段將目的DNA轉(zhuǎn)染入患者的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療疾病的目的。因此，選擇能高效、特異地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的目的基因成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵和難點(diǎn)?？谇埃鲁且卟《镜目鼓[瘤作用逐步為人們所重視并已轉(zhuǎn)入臨床研究階段，有分析表明，通過HN蛋白的篩選能夠引起抗原變異，并且能控制當(dāng)前流行的新城疫閔。1 NDV的結(jié)構(gòu)特性NDV

8、是一種有囊膜、單鏈、不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，在分類上屬于副黏病毒科(paramyxoviridae)的副黏病毒亞科(paramyxovirinae)中的腮腺炎病毒屬(rubulavirus),可感染禽類引起新城疫氣NDV的基因組包括6種基因，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，據(jù)分布位置不同可分為內(nèi)部蛋白和外部蛋白。內(nèi)部蛋白包括核衣殼蛋白（nucleocapsid,NP）、磷酸化蛋白（phosphateprotein,P）、高分子質(zhì)量RNA聚合前（largeprotein,L）;外部蛋白包括融合蛋白（fusionprotein,F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白及基質(zhì)蛋白（matrix,M）oNP、P及L蛋白在

9、功能上相互促進(jìn)，共同參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。其中，覆蓋在病毒囊膜表面的血凝素和神經(jīng)氨酸酶（HN）活性的糖蛋白、融合糖蛋白（F）以及脂膜內(nèi)的非糖基化內(nèi)膜蛋白（M）與病毒的脂質(zhì)膜有關(guān)，即HN和F蛋白為糖基化蛋白，構(gòu)成NDV的纖突，是NDV重要的免疫原成分。M蛋白為囊膜內(nèi)表面支撐物，與F蛋白具有協(xié)同作用，共同形成具有感染性的病毒粒子。另外3種蛋白，即核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）和高分子質(zhì)量蛋白（L）與基因組RNA有關(guān)HN蛋白的結(jié)構(gòu)與功能NDV中HN基因是構(gòu)成NDV囊膜上較大的纖突樣糖蛋白的主要編碼基因，其基因長1734bP,編碼577個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約63kD,兼有血凝素（HA）和神經(jīng)

10、敏酸酶（NA）雙重活性。其中，HA負(fù)責(zé)識別易感細(xì)胞的唾液酸受體并進(jìn)行吸附，實(shí)現(xiàn)病毒感染細(xì)胞的第一步過程。NA則水解.宿主細(xì)胞表面的唾液酸，分解并破壞受體，暴露宿主細(xì)胞的生物識別位點(diǎn)，促進(jìn)新生病毒粒子從感染細(xì)胞膜上釋放，同時(shí)，其還具有活化巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、穩(wěn)定活化的】'細(xì)胞的作用氣受體的識別取決于NA活性，但調(diào)節(jié)NA活性的HN殘基在促進(jìn)病毒吸附作用方面并非不可或缺，也就是說,NA活性發(fā)揮還需要其他HN蛋白的介導(dǎo)才能與受體結(jié)合。此外，HN蛋白還可直接作用于受體位點(diǎn)，并具有促進(jìn)F蛋白融合作用的啟動功能，HN蛋白通過去除新合成病毒核衣殼蛋白上的唾液酸，對子代病毒粒子進(jìn)行加工，使F蛋白充分

11、接近細(xì)胞，完成病毒與細(xì)胞膜的融合。有研究結(jié)果表明，嵌合體位FM（l+2）,包含SV41融合衍生結(jié)構(gòu)域Ml利1M2,共表達(dá)SV41HN蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間融合，表明這些結(jié)構(gòu)域參與決定HN蛋白的特異性。現(xiàn)12確定，HN蛋白中的E401、R416和Y526位氨基酸殘基對細(xì)胞與受體結(jié)合以及促進(jìn)融合發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HN蛋白的主要疏水區(qū)在N末端，即N末端是與病毒外膜的連接部位。在由75個(gè)鉗:基酸殘基構(gòu)成的N末端中，第126位氨基酸殘基為胞質(zhì)內(nèi)區(qū)（尾部）,第27-160（*氨基酸殘基為跨膜區(qū)（桿狀部）,其余氨基酸殘基為胞質(zhì)外氨基酸（球形頭部）o相對來說，各毒株HN蛋白的氨基酸差異主要

12、集中在N末端第175位，自第76位氨基酸起至C端的整個(gè)膜外區(qū)，氨基酸差異較小?？缒^(qū)和膜內(nèi)區(qū)均參與HN四聚體結(jié)構(gòu)的形成，當(dāng)二者缺失時(shí)，HN蛋白只能形成二聚體結(jié)構(gòu)叫HN蛋白中HA與NA兩個(gè)抗原位點(diǎn)是相互獨(dú)立的，即HA活性位點(diǎn)靠近HN蛋白C末端，NA活性位點(diǎn)位于HN蛋白中心。但在一級結(jié)構(gòu)中，其第193201位基基酸殘基同時(shí)參與了這兩種結(jié)構(gòu)的形成，因此，這兩個(gè)活性位點(diǎn)町能存在某種程度的折疊氣HN亞單位間通過二硫鍵形成二聚體，兩個(gè)二聚體以非共價(jià)鍵形成四聚體,故成熟的HN為四聚體寡聚蛋白。對于強(qiáng)毒株NDV-AV而言，每個(gè)同型二聚體的亞單位都是通過球形結(jié)構(gòu)域中第123位半胱忽酸（Cys）的二硫鍵相連接，其

13、中球形頭部由多個(gè)0片狀結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,第175228位、第237287位、第316396位、第401443位、第472515位和第520571位氨基酸分別為81、82、63、64、85和86（圖1）。球形頭部含有NA活性位點(diǎn)、受體識別位點(diǎn)和已知的所有抗原位點(diǎn)氣HN蛋白含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其中4個(gè)（119、341、433、481位氨基酸）保守性強(qiáng)，2個(gè)（508和538位氨基酸）保守性較差。糖基化作用不參與HN蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，但對NA活性的形成是必需的。新城疫病毒融合蛋白特異性序列對胞外構(gòu)象的活化、蛋白間的相互作用極其重要同。上述研究表明，HN蛋白在抗腫瘤方面不但介導(dǎo)了病毒吸附腫瘤細(xì)胞的過程，同時(shí)還

14、與融合蛋白一起協(xié)助病毒侵入細(xì)胞。4014U449498GAEGARRfUCNTTV$47NDVHN1741761瞬401416449498$26MPSDNKKSCSGAEGARRfUCNTTVY_C%瀏誦J5S圖1HN蛋白的球形結(jié)構(gòu)域和6個(gè)0片狀結(jié)構(gòu)域2 HN蛋白的抑瘤活性及其機(jī)制自從發(fā)現(xiàn)NDV能夠抑制腫瘤細(xì)胞以來，HN蛋白的抗腫瘤作用就一直受到研究者的重視。已進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)顯示，HN蛋白對惡性黑色素瘤和一些消化系統(tǒng)惡性腫瘤具有良好的治療效果。通過靜脈注射，HN蛋白可選擇性殺傷多種腫瘤細(xì)胞,卻對正常細(xì)胞無明顯的毒副作用氣隨著NDV抗腫瘤機(jī)制研究的不斷深入，HN蛋白在NDV抗腫瘤過程中發(fā)揮的

15、作用日益受到關(guān)注。HN蛋白抗腫瘤的機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾方面。3.1去除腫瘤細(xì)胞表面唾液酸，促進(jìn)T細(xì)胞識別細(xì)胞發(fā)生突變或癌變后，存在許多導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制。其中，唾液酸(sialicacid,SA)遮蔽是主要原因之一。SA位于細(xì)胞表面，它既有掩蓋細(xì)胞膜、阻止細(xì)胞被識別的功能,同時(shí)其自身又能形成特殊的識別位點(diǎn)，從而遮蓋細(xì)胞表面抗原，導(dǎo)致機(jī)體免疫細(xì)胞無法正確識別”氣因此，不能發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。SA作為細(xì)胞膜糖蛋白的重要組分，在機(jī)體組織和體液中廣泛分布，參與細(xì)胞的識別、黏附和接觸抑制等過程。SA已成為臨床上一種廣j普腫瘤標(biāo)志物，可通過對血清中SA濃度的測定，將其作為診斷腫瘤的輔助指

16、標(biāo)和療效觀察指標(biāo)。臨床檢測結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞表面SA的含量明顯高于正常細(xì)胞，細(xì)胞表面抗原因受到SA的遮蔽而無法被免疫細(xì)胞識別，因此，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫防御而得以擴(kuò)散。HN蛋白通過HA位點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞表面SA結(jié)合后，在NA的作用下,SA從腫痛細(xì)胞表面脫落,導(dǎo)致細(xì)胞表面負(fù)電荷減少，細(xì)胞間排斥力降低，這更利于腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的接觸和抗原信息的傳遞。由于SA的脫落，使原本被遮蔽的腫瘤抗原也得到充分暴露，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫原性隨之增強(qiáng)。以禽痘病毒為載體，將HN基因?qū)隑16腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了HN蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)，且B16細(xì)胞表面的SA含量顯著降低，表明單純表達(dá)HN蛋白也可獲得HA識別、結(jié)合SA受體以及NA

17、降解SA活性的效應(yīng)“°'。3.2HN增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表面的粘附性腫瘤細(xì)胞因缺乏黏附分子和共刺激分子而難以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)。HN能在腫瘤細(xì)胞表面產(chǎn)生類似于抗原細(xì)胞表面的黏附分子和共剌激分子，即在增強(qiáng)淋巴細(xì)胞黏附力的同時(shí)，還可刺激淋巴細(xì)胞分化，激活淋巴細(xì)胞有研究報(bào)道，經(jīng)HNcDNA修飾的腫瘤細(xì)胞制備的瘤苗，可增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的活性，誘發(fā)動物及病人產(chǎn)生全身性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，NDV誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL反應(yīng)的主要途徑是通過HN分子的細(xì)胞黏附和血凝活性實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)還證明NDV的抗腫瘤作用與NDV顆粒表面HN的活性有關(guān)向。有研究表明，新城疫病毒的F蛋白和HN蛋白在感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵

18、性作用，NDV中的Anhinga/93替換成F或HN基因能顯著提高病毒巨噬細(xì)胞的復(fù)制能力凹。3.3HN促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的活化和腫瘤細(xì)胞凋亡免疫系統(tǒng)中大部分細(xì)胞都可表達(dá)TRAIL,單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞接受I型干擾素(IFN-a)和II型干擾素(IFN-Y)刺激后，可以檢測到TRAIL的表達(dá)凹。其原因是病毒感染后，干擾素表達(dá)水平上調(diào)，繼而誘導(dǎo)TRAIL表達(dá)。體內(nèi)試驗(yàn)也表明，鼠肝臟NK細(xì)胞在經(jīng)受IFN-Y刺激后，TRAIL表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了NK細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞向肝臟轉(zhuǎn)移的細(xì)胞毒性叫。研究發(fā)現(xiàn)，M經(jīng)NDV剌激后，可殺傷各種人類腫瘤細(xì)胞，M中的殺腫瘤特性正是通過TRAIL介導(dǎo)的叫NDV誘導(dǎo)M。表達(dá)TRA

19、IL時(shí)不依賴于病毒的復(fù)制，經(jīng)紫外線滅活的NDV0燃具有誘導(dǎo)TRAIL表達(dá)的效果。進(jìn)一步研究也證實(shí)，HN蛋白介導(dǎo)了NDV刺激下外周血單核細(xì)胞對IFN-a和TRAIL分泌的調(diào)節(jié)作用問。3 HN蛋白抑制腫瘤的應(yīng)用前景鑒于在I期臨床應(yīng)用時(shí)使用NDV感染治療有散毒的潛在危險(xiǎn)，目前的研究方向是將NDV的抗腫瘤HN基因進(jìn)行克隆，以抗腫瘤基因的真核重組體的表達(dá)產(chǎn)物取代完整病毒，從而克服了完整病毒所引起的副作用及可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而確保安全性和細(xì)胞疫苗無法比擬的優(yōu)越性，這為HN作為生物制劑替代NDV全病毒用于抗腫瘤治療提供了科學(xué)依據(jù)。在由NDV介導(dǎo)的抗腫瘤過程中，HN蛋白具有增加腫瘤細(xì)胞對淋巴細(xì)胞的粘附力、刺激

20、淋巴細(xì)胞的分化和改變腫瘤細(xì)胞免疫原性的作用，因此，HN蛋白是NDV抗腫瘤作用的主要分子基礎(chǔ)，在人類腫瘤性疾病生物防控中具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。NDV抗腫瘤作用的機(jī)制之一是通過病毒感染腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)針對腫瘤抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。但目前的研究與應(yīng)用大部分還都局限于全病毒修飾疫苗或NDV溶痛株體外裂解瘤細(xì)胞，而后再回輸入體內(nèi)。顯然，利用這種方法抑制腫瘤存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。具體體現(xiàn)在：(1)利用病毒進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)不可避免地會產(chǎn)生抗體，這些抗體在很大程度上限制了病毒的反復(fù)使用，這是制約NDV進(jìn)一步應(yīng)用于抗腫瘤臨床治療的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。(2)若體內(nèi)試驗(yàn)中瘤

21、細(xì)胞滅活或裂解不徹底，會產(chǎn)生人為種植腫瘤的危險(xiǎn)。(3)NDV可能對機(jī)體造成感染，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，并且其非有效成分還町能導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)過敏反應(yīng)。盡管如此，利用NDV治療腫瘤的研究方興未艾，它是一種令人鼓舞的基因治療手段。但生物療法畢竟尚未完全成熟，尤其是、DV抗腫瘤的確切機(jī)制尚未完全闡明，因此，在該領(lǐng)域還需進(jìn)行更深一步的研究和探索。參考文獻(xiàn)：(1JGuM,LiuWJ,XuLJ,etal.Positiveselectioninthehemagglutinin-neuraminidasegeneofNewcastlediseasevirusanditseffectonvaccineeflicacyfj

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