基因工程DNA文庫(kù)構(gòu)建

1、基因工程DNA文庫(kù)構(gòu)建構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序：構(gòu)建基因文庫(kù)的基本程序： 提取研究對(duì)象基因組提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器片段，或提取組織或器官的官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成并反轉(zhuǎn)錄成cDNA； DNA片段或片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA； 重組重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌； 陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇。陽(yáng)性重組菌落或噬菌斑的選擇。第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建一、基因組一、基因組DNA文庫(kù)的類(lèi)型和發(fā)展文庫(kù)的類(lèi)型和發(fā)展 質(zhì)粒文庫(kù)

2、質(zhì)粒文庫(kù) 噬菌體文庫(kù)噬菌體文庫(kù) 黏粒文庫(kù)黏粒文庫(kù) 人工染色體文庫(kù)人工染色體文庫(kù) 亞基因組文庫(kù)亞基因組文庫(kù)鳥(niǎo)槍法（霰彈法）：利用機(jī)械剪切力和超聲波等物理鳥(niǎo)槍法（霰彈法）：利用機(jī)械剪切力和超聲波等物理方法或限制性核酸內(nèi)切酶酶切等生化方法將生物方法或限制性核酸內(nèi)切酶酶切等生化方法將生物chr.打打斷，隨后通過(guò)斷，隨后通過(guò)T4 DNA連接酶把這些片段與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒連接酶把這些片段與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化受體菌后進(jìn)行無(wú)性繁殖，獲得一載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化受體菌后進(jìn)行無(wú)性繁殖，獲得一大群含不同外源大群含不同外源DNA片段的克隆，再用簡(jiǎn)便的篩選方片段的克隆，再用簡(jiǎn)便的篩選方法從眾多的轉(zhuǎn)化菌株中篩選出含有某一

3、目的基因的菌法從眾多的轉(zhuǎn)化菌株中篩選出含有某一目的基因的菌株，從中獲得所要的基因。株，從中獲得所要的基因。代表性：代表性：指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的指文庫(kù)中所有克隆所攜帶的 DNA 片段重新組合起來(lái)可片段重新組合起來(lái)可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫(kù)中分離任何一段 DNA 。代表。代表性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。文庫(kù)構(gòu)建策略：文庫(kù)構(gòu)建策略：采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來(lái)消化染色體采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來(lái)消化染色體 DNA ，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段 DNA 在文庫(kù)中出

4、現(xiàn)的頻率均等；在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率均等；提高文庫(kù)所含基因組提高文庫(kù)所含基因組 DNA 的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來(lái)衡量。的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來(lái)衡量。二、文庫(kù)的代表性和隨機(jī)性二、文庫(kù)的代表性和隨機(jī)性三、基因組三、基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建流程文庫(kù)構(gòu)建流程 載體的制備；載體的制備； 高純度大分子量基因組高純度大分子量基因組 DNA 的提取；的提??； HMW DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGE size selection）；）； 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞； 重組克隆的挑取和保存。重組克隆的

5、挑取和保存。1基因組基因組 DNA 文庫(kù)的載體制備文庫(kù)的載體制備 載體的制備要求：載體的制備要求：純度高；純度高；去磷酸化好。去磷酸化好。2高質(zhì)量大分子量基因組高質(zhì)量大分子量基因組 DNA 的提取和部分酶切的提取和部分酶切 提取的基因組提取的基因組 DNA 要求保存完整。要求保存完整。 分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。3文庫(kù)的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染文庫(kù)的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染 在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過(guò)程中，首先選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞或效在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過(guò)程中，首先選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞或效價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白；同時(shí)，研究表明對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)

6、行脫鹽處理也價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白；同時(shí)，研究表明對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對(duì)于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對(duì)可以明顯地提高其效率。另外，對(duì)于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對(duì)不同插入片段的不同插入片段的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。4文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè) 文庫(kù)的平均插入片段長(zhǎng)度是通過(guò)文庫(kù)的平均插入片段長(zhǎng)度是通過(guò) PFGE 電泳檢測(cè)一定數(shù)目的重電泳檢測(cè)一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。美國(guó)的研究機(jī)構(gòu)對(duì)組子的插入片段大小所得平均值。美國(guó)的研究機(jī)構(gòu)對(duì) BAC 文庫(kù)，一文庫(kù)，一般要求植物的在般要求植物的在 130kb 左右，而動(dòng)物的

7、在左右，而動(dòng)物的在 150kb 左右。左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測(cè)的克隆中所占的比例。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測(cè)的克隆中所占的比例?；蚪M覆蓋倍數(shù)平均插入片段長(zhǎng)度基因組覆蓋倍數(shù)平均插入片段長(zhǎng)度克隆數(shù)克隆數(shù)/基因組基因組 DNA 的長(zhǎng)度的長(zhǎng)度（一般是約數(shù)（一般是約數(shù) ）；）； 基因組覆蓋度是指文庫(kù)中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測(cè)時(shí)是通過(guò)選基因組覆蓋度是指文庫(kù)中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測(cè)時(shí)是通過(guò)選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來(lái)篩選文庫(kù)。由于所使用的每擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來(lái)篩選文庫(kù)。由于所使用的每個(gè)探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫(kù)中對(duì)該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)，

8、因此，個(gè)探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫(kù)中對(duì)該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩到的陽(yáng)性克隆的總個(gè)數(shù)基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩到的陽(yáng)性克隆的總個(gè)數(shù)/使用的總探使用的總探針數(shù)的比值針數(shù)的比值 第二節(jié)第二節(jié) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)中的外源文庫(kù)中的外源 DNA 片段是互補(bǔ)片段是互補(bǔ) DNA （complementary DNA , cDNA）。）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈 cDNA 。 cDNA 文庫(kù)代表生物的某一特文庫(kù)代

9、表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因的群體，并不能包括該生定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因的群體，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達(dá)豐度上存在很大差異。物的全部基因，且這些基因在表達(dá)豐度上存在很大差異。 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建步驟：文庫(kù)構(gòu)建步驟： 細(xì)胞總細(xì)胞總 RNA 的提取和的提取和 mRNA 分離；分離； 第一鏈第一鏈 cDNA 合成；合成； 第二鏈第二鏈 cDNA 合成；合成； 雙鏈雙鏈 cDNA 克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖?？寺∵M(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。 mRNA 在總在總 RNA 中所占比例很小，因此從總中所占比例很小，因此從

10、總 RNA 中富集中富集 mRNA 是構(gòu)是構(gòu)建建 cDNA 文庫(kù)和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。文庫(kù)和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。 目前目前mRNA的純化的純化 方法：在固體支持物表面共價(jià)結(jié)合固定一段由脫方法：在固體支持物表面共價(jià)結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸 oligo（dT）鏈，由它與鏈，由它與 mRNA 的的 Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定?。┪舶碗s交，從而吸附固定住 mRNA ，進(jìn)而將，進(jìn)而將 mRNA 從其它組從其它組分中分離出來(lái)。分中分離出來(lái)。1mRNA 的完整性的完整性 指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力；指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力； 指

11、導(dǎo)合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和指導(dǎo)合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS-PAGE）；）； mRNA 的大?。ǖ拇笮。?00bp-8kb，多數(shù)，多數(shù)1.5-2kb）；）； 總總 mRNA 制劑指導(dǎo)合成制劑指導(dǎo)合成 cDNA 第一鏈長(zhǎng)分子的能力。第一鏈長(zhǎng)分子的能力。 一、一、 mRNA 的分離的分離3mRNA 的富集的富集 3.1 按大小對(duì)按大小對(duì) mRNA 進(jìn)行分級(jí)分離進(jìn)行分級(jí)分離 3.2 cDNA 的分級(jí)分離的分級(jí)分離近年來(lái)多采用此方法，特別是大近年來(lái)多采用此方法，特別是大 mRNA ，可避免降解，可避免降解 mRNA , agarose 分離大小易辨。分離大小易辨。 3.3 多

12、聚核糖體的免疫學(xué)純化法多聚核糖體的免疫學(xué)純化法用抗體來(lái)純化合成的目的多肽的多聚核糖體。用抗體來(lái)純化合成的目的多肽的多聚核糖體。 免疫親和柱免疫親和柱/ A蛋白蛋白-Sepharose 柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結(jié)合到的多聚核糖體結(jié)合到 A 蛋白蛋白-spharose 柱上，隨后用柱上，隨后用 EDTA 解離下來(lái)，解離下來(lái)，通過(guò)通過(guò) oligo（dT）層析分離）層析分離 mRNA 。此法分離的。此法分離的 mRNA 只占總只占總 mRNA 的的 0.01-0.05% 。2mRNA 的豐度的豐度 高豐度高豐度 mRNA ：在特定細(xì)胞中占：在特定細(xì)胞中占

13、 50-90%，如：免疫球蛋白，如：免疫球蛋白 。 低豐度低豐度 mRNA ：含量：含量 0.5% 被稱為低豐度或稀有被稱為低豐度或稀有 mRNA 。二、二、cDNA 第一鏈的合成第一鏈的合成常用的反轉(zhuǎn)錄酶：常用的反轉(zhuǎn)錄酶： AMV （來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒）（來(lái)自禽成髓細(xì)胞瘤病毒） MMLV （來(lái)自（來(lái)自 Moloey 鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）依賴于依賴于 RNA 的的 DNA 聚合酶，有聚合酶，有 5-3 DNA 聚合酶活性。聚合酶活性。合成合成 DNA 常用的引物：常用的引物： Oligo（dT）和隨機(jī)引物。）和隨機(jī)引物。 Oligo（dT）引）引物一般包含物一般包含 1020 個(gè)脫氧

14、胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含 610 個(gè)堿基的寡核苷酸短片個(gè)堿基的寡核苷酸短片段。段。 Oligo（dT）引導(dǎo)的）引導(dǎo)的 cDNA 合成是在合成是在 cDNA 的合成過(guò)程中加入高濃度的的合成過(guò)程中加入高濃度的 Oligo（dT）引物，）引物， Oligo（dT）引物與）引物與 mRNA 的的 3 末端的末端的 poly（A）配）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以 mRNA 為模板合成第一鏈為模板合成第一鏈 cDNA 。這種。這種 cDNA 合成的合成的方法在方法在 cDNA 文

15、庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)主要是由于文庫(kù)構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)主要是由于 cDNA 末端存末端存在較長(zhǎng)的在較長(zhǎng)的 poly（A）而影響）而影響 cDNA 測(cè)序。測(cè)序。 隨機(jī)引物引導(dǎo)的隨機(jī)引物引導(dǎo)的 cDNA 合成是采用合成是采用 610 個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來(lái)錨個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來(lái)錨定定 mRNA 并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條 mRNA 鏈上有多個(gè)鏈上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)而從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長(zhǎng)的結(jié)合位點(diǎn)而從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長(zhǎng)的 mRNA 分子的分子的 5-端序列。隨機(jī)引物端序列。隨

16、機(jī)引物 cDNA 合成的方法不適合構(gòu)建合成的方法不適合構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)，一般用于克隆文庫(kù)，一般用于克隆特定特定 mRNA 的的 5 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5-RACE 。 1自身引導(dǎo)法：自身引導(dǎo)法： 首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的 mRNA 鏈，解離的第一鏈鏈，解離的第一鏈 cDNA 的的 3-末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈 cDNA 合成時(shí)的特性，原因至今未知，據(jù)推測(cè)可能是與帽子的特殊結(jié)構(gòu)相合成時(shí)的特性，原因至今未知，據(jù)推測(cè)可能是與帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)），并引導(dǎo)關(guān)），并引導(dǎo) DNA 聚合

17、酶復(fù)制出第二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之間是連聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用接在一起的，再利用 S1 核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。三、三、cDNA 第二鏈的合成第二鏈的合成2置換合成法：置換合成法：RNaseH：將：將mRNAcDNA 雜合雙鏈中的雜合雙鏈中的 mRNA 鏈切割成很多的鏈切割成很多的小片段；小片段；大腸桿菌大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 ：以形成的小片段為引物，以第一鏈：以形成的小片段為引物，以第一鏈 cDNA 為模板合為模板合成一段段互補(bǔ)的成一段段

18、互補(bǔ)的 cDNA 片段。片段。 DNA 連接酶：合成的這些小連接酶：合成的這些小cDNA片段被連接成一條鏈。片段被連接成一條鏈。3引導(dǎo)合成法：引導(dǎo)合成法： 本方法是本方法是 Okayama 和和 Berg 1982 提出的。首先是制備一端帶有提出的。首先是制備一端帶有 Poly（dG）的片段）的片段 和帶有和帶有 Poly（dT）的載體片段）的載體片段 ，并用片，并用片段段 來(lái)代替來(lái)代替 Oligo（dT）進(jìn)行）進(jìn)行 cDNA 第一鏈的合成，在第一鏈第一鏈的合成，在第一鏈 cDNA 合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈）在第一鏈 cDNA 的的 3-端端加上一段

19、加上一段 Poly（dC）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段與片段 一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在 RNaseH 、大腸桿菌大腸桿菌 DNA 聚合酶聚合酶 和和 DNA 連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈在一起的雙鏈 cDNA 。其主要特點(diǎn)是合成全長(zhǎng)。其主要特點(diǎn)是合成全長(zhǎng) cDNA 的比例較高，的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的但操作比較復(fù)雜，形成的 cDNA 克隆中都帶有一段克隆中都帶有一段 Poly（dC）/（dA），對(duì)重組子的復(fù)制和測(cè)序都不利。），對(duì)重組子

20、的復(fù)制和測(cè)序都不利。 4引物銜接頭合成法引物銜接頭合成法第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈 cDNA 的的 3-端加上一段端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的的尾巴，然后用一段帶接頭序列的 Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的 cDNA 鏈，接頭序列可以是適用于鏈，接頭序列可以是適用于 PCR 擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成 PCR 法構(gòu)建法構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)的常用方法。文庫(kù)的常用方法。 c

21、DNA 克隆時(shí)常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長(zhǎng)時(shí)間獲得全長(zhǎng)克隆時(shí)常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長(zhǎng)時(shí)間獲得全長(zhǎng) cDNA 克克隆。隆。 cDNA 克隆中克隆中, 得到了不完整的片段得到了不完整的片段, 可采用此方法獲得可采用此方法獲得 3 末端和末端和 5 末末端的序列。工作原理見(jiàn)后圖。篩選文庫(kù)時(shí)一般只能回收一個(gè)或幾個(gè)端的序列。工作原理見(jiàn)后圖。篩選文庫(kù)時(shí)一般只能回收一個(gè)或幾個(gè) cDNA 克隆，克隆， 而而 RACE 可產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆。引物可產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆。引物 GSP1 根據(jù)已經(jīng)得到的不完整根據(jù)已經(jīng)得到的不完整的的 cDNA 的序列設(shè)計(jì)。的序列設(shè)計(jì)。 （3） RACE（ random amp

22、lification of cDNA ends） 第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略 一般來(lái)說(shuō)，這一篩選過(guò)程的難易程度，主要取決于所一般來(lái)說(shuō)，這一篩選過(guò)程的難易程度，主要取決于所采用基因的克隆方案和目的基因的性質(zhì)與來(lái)源。從文庫(kù)中采用基因的克隆方案和目的基因的性質(zhì)與來(lái)源。從文庫(kù)中篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的免疫學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法、PCR篩選法。篩選法。 基因克隆的本質(zhì)：從文庫(kù)中篩選目標(biāo)克隆，重點(diǎn)在篩選?；蚩寺〉谋举|(zhì)：從文庫(kù)中篩選目標(biāo)克隆，重點(diǎn)在篩選。常見(jiàn)篩選工具：探針（常見(jiàn)篩選工具：探針（probe）

23、狹義：核酸，抗體狹義：核酸，抗體 廣義：還包括其他篩選手段。廣義：還包括其他篩選手段。 生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過(guò)生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過(guò)觀察表型的變化來(lái)篩選目的基因。表型篩選法就是根據(jù)目的基因編觀察表型的變化來(lái)篩選目的基因。表型篩選法就是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來(lái)，這樣就中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來(lái)，這樣就很容易通過(guò)導(dǎo)入的基因帶來(lái)新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來(lái)

24、確定目很容易通過(guò)導(dǎo)入的基因帶來(lái)新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來(lái)確定目的基因。的基因。一、表型篩選法一、表型篩選法 抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因 分解基因：苯環(huán)化合物、分解酶分解基因：苯環(huán)化合物、分解酶 功能活性：殺蟲(chóng)、酶功能活性：殺蟲(chóng)、酶 啟動(dòng)子啟動(dòng)子/復(fù)制子：復(fù)制子： 功能缺失：在獲得相應(yīng)突變體的前提下，以此突變體作為宿主，功能缺失：在獲得相應(yīng)突變體的前提下，以此突變體作為宿主，將野生型的將野生型的DNA導(dǎo)入后檢測(cè)回復(fù)突變（如：營(yíng)養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基導(dǎo)入后檢測(cè)回復(fù)突變（如：營(yíng)養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因）。因）。 當(dāng)目標(biāo)基因是未知功能的基因或一些不能在原

25、核生物中表達(dá)當(dāng)目標(biāo)基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達(dá)的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，此時(shí)就必須考慮其它的方法源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，此時(shí)就必須考慮其它的方法來(lái)篩選。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目標(biāo)基因克隆的一種來(lái)篩選。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目標(biāo)基因克隆的一種方法。方法。二、雜交篩選二、雜交篩選 同源同源DNA探針：探針： 高度保守的基因高度保守的基因 rRNA基因基因 鄰近種屬的相應(yīng)基因鄰近種屬的相應(yīng)基因 相應(yīng)基因的序列比較相應(yīng)基因的序列比較 合成寡核苷

26、酸：合成寡核苷酸： 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)N-末端末端aa序列序列 簡(jiǎn)并探針簡(jiǎn)并探針 根據(jù)密碼子的使用頻率，合成猜測(cè)體探針根據(jù)密碼子的使用頻率，合成猜測(cè)體探針 設(shè)計(jì)兩組簡(jiǎn)并探針，用第二個(gè)探針對(duì)第一次篩選的陽(yáng)性克隆子作設(shè)計(jì)兩組簡(jiǎn)并探針，用第二個(gè)探針對(duì)第一次篩選的陽(yáng)性克隆子作第二次雜交第二次雜交實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組mRNA & 對(duì)照組對(duì)照組mRNA 分別制備探針（分別制備探針（mRNA或或cDNA) 分別篩選含目的基因的分別篩選含目的基因的cDNA文庫(kù)文庫(kù) 陽(yáng)性菌落陽(yáng)性菌落x光底片顯色光底片顯色 比較比較x光底片和對(duì)照平板，挑出含目的基因的菌落光底片和對(duì)照平板，挑出含目的基因的菌落 鑒定目的基因鑒定目的基因

27、 (一一) 差別雜交差別雜交 (differential hybridization )優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) - 簡(jiǎn)便、直觀簡(jiǎn)便、直觀缺點(diǎn)缺點(diǎn) - 敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達(dá)基因敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達(dá)基因 - 膜雜交篩選工作量大，信號(hào)強(qiáng)度可比性不佳膜雜交篩選工作量大，信號(hào)強(qiáng)度可比性不佳 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組mRNA&對(duì)照組對(duì)照組mRNA 反轉(zhuǎn)錄為單鏈反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA（量少）（量少）- 生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記mRNA（量多）（量多） 雜交雜交(約約1:20) 生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記mRNA：cDNA雜合子雜合子 與鏈球菌抗生物素蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)與鏈球菌抗生物素蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng) 生物素標(biāo)記

28、生物素標(biāo)記mRNA：cDNA雜合子交聯(lián)于鏈球菌抗生物素蛋白上雜合子交聯(lián)于鏈球菌抗生物素蛋白上 去雙鏈結(jié)構(gòu)去雙鏈結(jié)構(gòu) 單鏈單鏈cDNA 制備差減探針制備差減探針 & 構(gòu)建差減構(gòu)建差減cDNA文庫(kù)文庫(kù) 差減差減cDNA文庫(kù)篩選文庫(kù)篩選 鑒定目的基因鑒定目的基因(二二) mRNA 減法雜交減法雜交（subtractive hybridization)原理：原理：SSH是差減雜交與是差減雜交與PCR結(jié)合的簡(jiǎn)單、快速分離差異基因的方法。結(jié)合的簡(jiǎn)單、快速分離差異基因的方法。其運(yùn)用雜交動(dòng)力學(xué)原理，即豐度高的單鏈其運(yùn)用雜交動(dòng)力學(xué)原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快

29、于豐度低的單鏈的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使不同豐度的單鏈，從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；得到均衡；抑制抑制PCR則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu), 無(wú)法作為模板與引無(wú)法作為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使目的基因得物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使目的基因得到富集、分離。到富集、分離。（三）（三） 抑制性差減雜交抑制性差減雜交(suppressive subtractive hyb

30、ridization, SSH)方法：方法： 提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組mRNA合成雙鏈合成雙鏈cDNA，經(jīng)識(shí)別，經(jīng)識(shí)別4堿堿基的限制性內(nèi)切酶切基的限制性內(nèi)切酶切割；割； 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組cDNA平均平均分為分為2份，分別連接份，分別連接2個(gè)接頭；個(gè)接頭； 進(jìn)行進(jìn)行2輪差減雜交輪差減雜交和抑制和抑制PCR； 獲得富集的目的獲得富集的目的基因?；?。檢測(cè)組檢測(cè)組 (Tester) 含目的基因含目的基因cDNA，加接頭，加接頭驅(qū)逐組驅(qū)逐組 (Driver) 不含目的基因不含目的基因cDNA，不加接頭，不加接頭 * 接頭含接頭含PCR 引物引物正向正向SSH: 易感者易感者(Tester) +

31、 不易感者不易感者(Driver) 易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因 反向反向SSH: 不易感者不易感者(Tester) + 易感者易感者(Driver) 不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因優(yōu)點(diǎn)：采用兩次差減雜交和兩次優(yōu)點(diǎn)：采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性，保證了高特異性 (假陽(yáng)性率可假陽(yáng)性率可降至降至6); 在雜交過(guò)程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度在雜交過(guò)程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達(dá)基因差異表達(dá)基因;操作相對(duì)簡(jiǎn)便，是目前分離新基因的主要方法。操作相對(duì)簡(jiǎn)便，是目前分離新基因的主要方法。缺點(diǎn)：起始材料需要缺點(diǎn)：

32、起始材料需要g級(jí)量級(jí)量mRNA; SSH差減克隆片段較小，獲取差減克隆片段較小，獲取cDNA全全長(zhǎng)序列有一定難度。長(zhǎng)序列有一定難度。三、免疫篩選三、免疫篩選 免疫篩選法和核酸雜交的方法類(lèi)似，只是其使用的探針不是免疫篩選法和核酸雜交的方法類(lèi)似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細(xì)胞中存在抗原蛋白的表達(dá)，用于篩選的要在宿主細(xì)胞中存在抗原蛋白的表達(dá)，用于篩選的 DNA 文庫(kù)必須文庫(kù)必須是表達(dá)文庫(kù)，通常是原核生物的基因組是表達(dá)文庫(kù)，通常是原核生物的基因組 DNA 文庫(kù)和真核生物的文庫(kù)和真核生物的

33、cDNA 表達(dá)文庫(kù)。而且，所檢測(cè)的對(duì)象為宿主中不編碼的基因或宿表達(dá)文庫(kù)。而且，所檢測(cè)的對(duì)象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達(dá)的基因。主中缺失表達(dá)的基因。四、高表達(dá)基因四、高表達(dá)基因 高豐度高豐度mRNA，如用苯肼做了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中，如用苯肼做了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中，血紅蛋白血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數(shù)的含量占絕大多數(shù) mRNA3末端有末端有12種可能的序列；種可能的序列； 以此以此12種引物引導(dǎo)種引物引導(dǎo)cDNA第一鏈合成；第一鏈合成； 以以10nt隨機(jī)引物引導(dǎo)隨機(jī)引物引導(dǎo)cDNA第二鏈合成，可產(chǎn)生第二鏈合成，可產(chǎn)生50-100條條100-500bp的條帶；的條帶； 12種

34、錨定引物和種錨定引物和20種隨機(jī)引物組成種隨機(jī)引物組成240組引物，產(chǎn)生約組引物，產(chǎn)生約20000種種DNA條帶。條帶。五、五、mRNA差別顯示差別顯示 酵母雙雜交系統(tǒng)由酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，中建立。典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子， 如如GAL4、GCN4、等都含有二、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與可與DNA序列的特定位點(diǎn)即上序列的特定位點(diǎn)即上游激活序列結(jié)合；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域游激活序列結(jié)合；轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域協(xié)助協(xié)助RNA聚合酶聚合酶復(fù)合體激活復(fù)合體激活上游激活序列（上游激活序列（UAS）下游基因的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能是獨(dú)立）下游基因的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的