核酸分離純化及電泳

1、基因工程原理Introduction to genetic engineerins一、基因工程的定義：在體外對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。二、基因工程誕生的理論基礎(chǔ)1 . DNA是遺傳物質(zhì)1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的

2、雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)制。3、中心法則與遺傳密碼1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等終于破譯了64個(gè)遺傳密碼在遺傳學(xué)上，把遺傳信息的流動(dòng)方向叫做信息流。信息流的方向可以用科學(xué)家克里克提出的“中心法則”來表示。從“中心法則”可以看出，遺傳信息的一般流動(dòng)方向（圖中紅線所示）是：遺傳信息可以從DNA流向DNA，即完成DNA的自我復(fù)制過程，也可以從DNA流向RNA，進(jìn)而流向蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后,

3、細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。 三、基因工程誕生的技術(shù)突破1. 限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes）1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。2. DNA連接酶（ligase）1967年5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。3. 載體（vector）1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和l噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴(kuò)增。4. 感受態(tài)體系1970年M. Mandel和A. Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過

4、氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S. Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。5. 瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開。6. DNA測(cè)序技術(shù)1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert發(fā)明了DNA快速測(cè)序技術(shù)。四、基因工程的特征1. 跨物種性外源基因到另一種不同的生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖。2. 無性擴(kuò)增外源DNA在寄主細(xì)胞內(nèi)可大量擴(kuò)增，和高水平表達(dá)。五、基因工程的主要操作內(nèi)容1. 目的基因的獲取從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2. 重組體的制備將目的基因

5、的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆（含有目的基因）。5.目的基因表達(dá)使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。第一節(jié) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備溫度控制系統(tǒng)n 冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0Cn 恒溫培養(yǎng)箱：隔水式、電熱式n 鼓風(fēng)干燥箱n 恒溫水浴n 低溫循環(huán)水浴n 微量加熱器n 恒溫空氣搖床n PCR熱循環(huán)儀n 制冰機(jī)n 冷庫n 高壓蒸汽滅菌器電泳設(shè)備u 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)u 垂直板凝膠電泳系統(tǒng)u 轉(zhuǎn)移電泳系統(tǒng)u 紫外分析儀u 凝膠成像系統(tǒng)離心設(shè)備u

6、 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)u 高速冷凍離心機(jī)u 大容量離心機(jī)u 超速離心機(jī)分光光度計(jì)722S、7200可見分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)其它n PH計(jì)n 電子天平n 旋渦振蕩器n 磁力攪拌器n 超聲波破碎儀n 超凈工作臺(tái)n 純水器第一章 基因工程的主要技術(shù)原理第一節(jié) DNA的提取與純化由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實(shí)驗(yàn)條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法。一、質(zhì)粒DNA的提?。ㄒ唬?、質(zhì)粒載體概念 細(xì)菌質(zhì)粒是獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運(yùn)載克隆DNA的常用載體。 質(zhì)粒特點(diǎn)：染色體外的小型環(huán)狀分子，大小約為2200kb，通常以多拷

7、貝(可多達(dá)幾百個(gè))形式存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒含有復(fù)制起點(diǎn)(ori)用以保證質(zhì)粒的自主復(fù)制正常復(fù)制依賴宿主細(xì)胞中的聚合酶及其他成分。質(zhì)粒一般僅攜有幾個(gè)基因抗生素物質(zhì)的抗性基因。最常見的抗性基因是amp+基因，編碼可以降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素的內(nèi)酰胺酶。另一種常見抗性基因是tetA基因，編碼一種可以從細(xì)胞內(nèi)將四環(huán)素類抗生素排出的跨膜蛋白。pMD-18 T Vector pGEMT(二)、質(zhì)粒DNA的制備小量法：堿裂解法（11分30秒）大量法：CsCl密度梯度離心法（1分30秒）試劑盒：由于質(zhì)粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于大腸桿菌染色體DNA，可以用物理化學(xué)方法將它們相分離，例如堿裂解法。1 .堿抽提法提取質(zhì)粒D

8、NA（1）原理 閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；（2） 所用的試劑作用 溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的b-1，4糖苷鍵。 在堿性條件（pH>8）下有活性。 葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。 NaAc-HAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4.8。 用來

9、中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。 RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE緩沖液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 酚-氯仿蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。（3）堿抽提

10、法提取質(zhì)粒DNA的步驟 第一步：溶菌使用“溶液”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。Solution I 的配制：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性溶液II 破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）第四步：離心除去沉淀上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-

11、氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。. 小量法：堿裂解法（11分30秒）攜有目的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株數(shù)毫升液體培養(yǎng)基（LB）增殖至穩(wěn)定期(過夜培養(yǎng))離心 菌體沉淀小量制備法提取質(zhì)粒. 氯化銫梯度（1分30秒） 制備大量的質(zhì)?？勺鳛槌Ｓ每寺≥d體貯備，或用作大量酶解反應(yīng)的底物。此時(shí)CsCl密度梯度離心可被用來作為最終純化步驟。該步驟雖然有點(diǎn)費(fèi)力，但卻是獲得極純的超螺旋質(zhì)粒DNA的最佳方法。. 試劑盒（11分30秒） QIAGEN 等試劑盒 .一步法提取質(zhì)粒DNA（16分20秒）2. 影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素最重要的是：菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。（1）受體菌株一般

12、要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5a、JM109、XL1-Blue等。endA基因編碼核酸內(nèi)切酶，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。（2）質(zhì)?？截悢?shù)這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。二、基因組或其他DNA的提取1.細(xì)菌基因組DNA的制備一般過程及原理（1）細(xì)胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37 oC溫育。不用NaOH !（2）DNA純化CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。（3）沉淀DNA0.6倍體積的異丙醇。2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA的抽提一般過程及原理

13、：（1）組織粉碎動(dòng)物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。 組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（2）細(xì)胞裂解0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC溫育。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA用2倍體積的無水乙醇（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）（5）除去RNA污染用RNase。三、DNA的定量和純度測(cè)定1. 紫外光譜法原理：DNA（或 RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰用微量比色杯（10ml）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。2. 瓊脂糖

14、凝膠電泳估計(jì)原理：溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。四、DNA分子量的估計(jì)一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等。第二節(jié) DNA的凝膠電泳一、電泳的基本原理1. 帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率。 2. 電泳遷移率同電場(chǎng)的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 4. 摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以

15、及介質(zhì)的粘度有關(guān)。5. 如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）： 分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān): 分子量越大，移動(dòng)越慢。相同分子量的DNA:環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢。 二 、瓊脂糖凝膠電泳1. 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高 空隙小3.瓊脂糖凝膠的分辨力空隙大小決定其分辨分子大小的能力?？障缎。直媛矢撸?小

16、分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。瓊脂糖的濃度（%）分離DNA的片斷大小（bp）0.3 0.7 1.4500001000 200001000 6000300三 、聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。瓊脂糖凝膠電泳：100050000bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳：11000bp聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）分離DNA片斷大?。╞p）4.0 10.0 20.01000100 50025 501四、凝膠染色1. 染料溴化乙錠。Ethidium bromide （EB）2. 原理EB是扁平分子，能插入DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 EB在300n

17、m紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，即可顯示DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 熒光強(qiáng)度與DNA含量及大小成正比。UVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)OMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)第二節(jié) DNA克隆概述一、DNA克?。?通過將生物體基因組DNA片段作為自主復(fù)制載體的一部分進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的方式，使對(duì)該片段的分離及操作簡單化。 背景：長期以來，由于生物體內(nèi)某些蛋白質(zhì)或其他組分的含量稀少難以大量純化，造成對(duì)這些物質(zhì)的詳盡分子分析極其困難或者幾乎不可能。 一種途徑是直接分離負(fù)責(zé)某一蛋白質(zhì)表達(dá)的或某一產(chǎn)物形成的基因。然而每個(gè)生物體的基因組都很龐大、復(fù)雜，且任一目的基因序列通常在單個(gè)細(xì)胞中只出現(xiàn)一到兩次，因此標(biāo)準(zhǔn)

18、的化學(xué)或生化方法都不能被用來分離基因組中的特定區(qū)域以對(duì)其進(jìn)行研究，尤其是當(dāng)目的DNA序列與所有其他序列具有化學(xué)相同性時(shí)更加困難。 解決這一難題的方法是將基因組中攜有該基因或其他相關(guān)序列的較小片段連接到一段可以自主復(fù)制的DNA即載體上，形成通?？梢栽诹硪凰拗髦羞M(jìn)行復(fù)制的重組DNA，這種復(fù)制是獨(dú)立于原初基因組的。帶有重組DNA的宿主細(xì)胞的增殖構(gòu)成了一群具有遺傳一致性的個(gè)體，或稱為單克隆。這一系列操作過程就被稱作DNA克隆。在進(jìn)行DNA克隆中，通常將以下操作、制作或生產(chǎn)歸為遺傳工程范疇：u DNA序列分析，以及由此派生的蛋白質(zhì)序列分析u 對(duì)基因啟動(dòng)子及其他調(diào)控序列的分離與分析u 通過大量正常和突變形

19、式的產(chǎn)物研究來了解這些蛋白質(zhì)酶RNA的功 能u 突變的鑒定，例如由于基因缺陷導(dǎo)致形成的疾病u 生物技術(shù)，如蛋白質(zhì)及其他重要生物功能的分子如人胰島素和生長素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)u 工程動(dòng)物、工程植物以及基因治療u 改變了特性的工程蛋白質(zhì) 二、宿主和載體 基因克隆過程中的大多數(shù)常規(guī)操作中都使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞。 質(zhì)粒和噬菌體可作為大腸桿菌的克隆載體。質(zhì)粒、病毒及整個(gè)染色體的載體一直被用作外源基因?qū)肫渌思罢婧松矬w內(nèi)的工具。 1.環(huán)狀質(zhì)粒： 染色體外(與染色體相獨(dú)立的)2. 許多噬菌體(侵染細(xì)菌的病毒)：v 噬菌體：可用來克隆較大的DNA片段，v 噬菌體M13：可以使克隆DNA以單鏈形式被提

20、取出來。v T載體：v 黏粒:質(zhì)粒入噬菌體雜合體。3.酵母: 酵母質(zhì)粒載體(酵母游離型質(zhì)粒，yeast episomal plasmid)，對(duì)于植物一種細(xì)菌質(zhì)粒(根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid)4.病毒: 其他真核細(xì)胞，常用那些能自然侵染目標(biāo)物種的病毒作為載體將其DNA維持在染色體外，或者是整合到宿主基因組(例如SV40、桿狀病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒)。 三、亞克隆 是克隆實(shí)驗(yàn)中最簡單的一種，即將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體的轉(zhuǎn)移，這一過程被稱為亞克隆。 亞克隆可用來對(duì)較大的克隆片段上較短區(qū)段進(jìn)行仔細(xì)研究，或是將基因轉(zhuǎn)移到能在特定物

21、種中表達(dá)的另一載體上。就大腸桿菌的質(zhì)粒載體來說，最常見的亞克隆程序可分為以下步驟：含有目標(biāo)克隆序列的質(zhì)粒DNA的提取用限制性內(nèi)切核酸酶將質(zhì)粒酶切成不連續(xù)的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離片段純化目標(biāo)片段將目標(biāo)片段連接在一新質(zhì)粒載體上，形成新的重組分子將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入某一大腸桿菌菌株(轉(zhuǎn)化，transformation)轉(zhuǎn)化細(xì)菌的篩選重組質(zhì)粒的分析四、DNA文庫由基因組或cDNA的一套隨機(jī)克隆片段構(gòu)成，其中每個(gè)片段連在一個(gè)單獨(dú)的載體分子上，常用來分離未知基因。 基因組文庫是用基因組DNA的隨機(jī)片段制備成的。缺點(diǎn)：用基因組文庫來克隆某一基因是一種效率極低的方法，特別是對(duì)于龐大的真核生物基因組。用于鑒定未

22、知基因的克隆實(shí)驗(yàn)的DNA有兩個(gè)主要來源：Ø 目的物種的基因組DNA。Ø 用來自表達(dá)目的基因細(xì)胞或組織的mRNA作為來源構(gòu)建成的文庫即cDNA文庫。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄將mRNA合成cDNA(DNA拷貝)后，插入載體構(gòu)建成cDNA文庫。五、篩選文庫1、 通常是用一段與目的基因序列的某一區(qū)段互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的放射性或熒光標(biāo)記的DNA探針，通過雜交來檢測(cè)出該基因。若基因的蛋白產(chǎn)物可獲得，則探針可以是從該蛋白產(chǎn)物序列推測(cè)出的一段寡核苷酸，或者探針也可以來自另一物種中的某一相關(guān)基因。制備探針越來越常用的一種方法是聚合酶鏈反應(yīng)PCR。2. 另一篩選方法是基于文庫中被克隆的編碼區(qū)表達(dá)后，對(duì)其蛋白產(chǎn)物進(jìn)

23、行活性鑒定，或是用特異抗體對(duì)其進(jìn)行鑒定。六、克隆分析含有目的基因的克隆被確定，通過限制性酶切圖譜即用限制性酶切來分析DNA片段，來對(duì)其克隆的片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，以至最終對(duì)全長片段進(jìn)行測(cè)序。隨后可通過將所得全長序列與數(shù)據(jù)庫中其他已知序列進(jìn)行比較分析，確定出該蛋白產(chǎn)物的完整序列。在體外進(jìn)行DNA克隆與分析要用到許多酶，其中常用酶的特性特列于表G11中，詳細(xì)描敘其應(yīng)用的章節(jié)也已列于其后。 酶用途堿性磷酸酶從雙鏈或單鏈DNA，或RNA的5端移去磷酸基。DNA連接酶(來自噬菌體T4由ATP水解提供能量，將dsDNA的戊糖磷酸骨架的5磷酸與3羥基相結(jié)合。待連接的DNA末端必須是相匹配的，即平端與

24、平端，或?yàn)榛パa(bǔ)的黏性末端。DNA聚合酶I由含游離3羥基的引物起始，沿5至3的方向合成與DNA模板互補(bǔ)的DNA鏈。Klenow片段是DNA聚合酶I的缺失5至3外切核酸酶活性的截短部分。外切核酸酶III外切核酸酶從線性DNA的末端依次切除核苷酸。外切核酸酶只從dsDNA的3端切割。綠豆核酸酶降解單鏈核酸，留下完整的雙螺旋區(qū)段。核酸酶S1類似綠豆核酸酶，并且能夠降解對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈缺刻對(duì)面的單鏈。多核苷酸激酶一個(gè)依賴ATP的反應(yīng)，向雙鏈或單鏈DNARNA的5'-羥基末端添加磷酸基。若使用-32p ATP，則可將DNA標(biāo)記上放射性同位素。限制酶在識(shí)別序列處(通常對(duì)稱)切割dsDNA的雙鏈。水解戊糖

25、磷酸骨架，使其一端為5'-磷酸基而另一端為3'羥基，形成平端或“黏”末端(5'或3'凸端)反轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶。由含有游離3羥基的引物起始，沿5'至3'方向合成與RNA模板互補(bǔ)的DNA鏈，需要dNTP。RNase A只降解RNA，而不降解DNA的核酸酶RNase H降解RNA-DNA異源雙鏈中的RNA鏈的核酸酶。T7，T3和SP6 RNA聚合酶分別由相應(yīng)的噬菌體編碼的專一性RNA聚合酶。每種酶只能識(shí)別自身的噬菌體DNA的啟動(dòng)子，特異地轉(zhuǎn)錄各自啟動(dòng)子下游DNA序列。Taq DNA聚合酶來源于嗜熱細(xì)菌(Thermusaquatzcus)的

26、DNA聚合酶。最適溫度為72，在90以上仍相當(dāng)穩(wěn)定。用于PCR。末端轉(zhuǎn)移酶可將核苷酸加到線性單鏈或雙鏈DNA或RNA的3端。如只用GTP，則僅加上多個(gè)G。工具酶聚合酶名 稱活 性主 要 用 途DNA 聚合酶I(全酶）5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶5-3外切酶切口平移法標(biāo)記3末端標(biāo)記Klenow片段5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶末端補(bǔ)平、末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成T4噬菌體DNA 聚合酶外切核酸酶活性比Klenow片段活性高200倍體外誘變T7噬菌體DNA 聚合酶5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶熱穩(wěn)定DNA依賴性的DNA聚合酶耐熱PCR反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNAcDNA的合成末端轉(zhuǎn)移酶在2價(jià)陽離子存在時(shí)催化dNTP加于DNA分子的3羥基端cDNA末端加同聚尾末端標(biāo)記依賴于DNA的RNA 聚合酶以DNA為模板合成RNA合成單鏈RNA做