實(shí)驗(yàn)四-微生物平板菌落計(jì)數(shù)法

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)四 微生物平板菌落計(jì)數(shù)法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，所以，長成的一個(gè)單菌落也可能來自樣品中的23或更多個(gè)細(xì)胞。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低，為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位（cfu）而不以絕對(duì)

2、菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。 平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。 三、實(shí)驗(yàn)器材 1 菌種：酵母菌。 2 培養(yǎng)基：YEB培養(yǎng)基。 3 儀器或其他用具： 1ml 無菌吸管，無菌平皿，盛有 4.5ml 無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1 編號(hào) 取無菌平皿 9 套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明 10-4 、 10-5 、 10-6 （稀釋度）各 2 套，另取 6 支盛有 4.5ml 無菌水的試

3、管，依次標(biāo)是 10-1 、 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、 10-6 。 2 稀釋 用 1ml 無菌吸管吸取 1ml 已充分混勻的大腸桿菌菌懸液（待測(cè)樣品），精確地放 0.5ml 至 10-1 的試管中，此即為 10 倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。 將 10-1 試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支 1ml 吸管插入 10-1 試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時(shí)不要太猛太快，吸時(shí)吸管伸入管底，吹時(shí)離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取 10-1 菌液 1ml ，精確地放 0.5ml 至 10-2 試

4、管中，此即為 100 倍稀釋。······其余依次類推。 放菌液時(shí)吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個(gè)稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。 3 倒平板法：1）取樣。用三支 1ml 無菌吸管分別吸取 10-4 、10-5 和 10-6 的稀釋菌懸液各 1ml ，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中，每個(gè)平皿放 0.2ml 。 不要用 1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2ml 稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個(gè)重復(fù)平板間的操作誤差。 2） 倒平板。盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至 45 左右的LB培

5、養(yǎng)基約 15 毫升 / 平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或?yàn)R到平皿蓋上。 由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并已冷卻至 45 左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計(jì)數(shù)。 3）待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于 37 恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 4.涂布法：涂抹平板計(jì)數(shù)法與倒平板法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用無菌吸管吸取0.1ml菌液對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)三個(gè)重復(fù)）。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻（圖22-3），每個(gè)稀釋度用

6、一個(gè)滅菌刮鏟，更換稀釋度時(shí)需將刮鏟灼燒滅菌。在由低濃度向高濃度涂抹時(shí)，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，保溫培養(yǎng)，至長出菌落后即可計(jì)數(shù)。5 計(jì)數(shù) 培養(yǎng) 48h 后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：每毫升中菌落形成單位（ cfu ） = 同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)× 5 一般選擇每個(gè)平板上長有 30300 個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適，同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)對(duì)照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗(yàn)不精確。實(shí)際工作中同一稀釋度重復(fù)三個(gè)對(duì)照平板不能少于三個(gè)

7、，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，減少誤差。由 10-4 、 10-5 和 10-6 三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。 平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后，所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在 50 個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入下表： 稀釋度 10-4 10-5 10-6 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 Cfu 數(shù) / 平板                         每毫升中的 cfu 數(shù)       六、 思考題 （ 1 ）為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至 45 左右才能倒平板？ （ 2 ）要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？ （ 3 ）試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接