分子生物學(xué)實驗基礎(chǔ)介紹

1、分子生物學(xué)的實驗方法和技巧分子生物學(xué)的實驗方法和技巧張照康張照康20162016年年5 5月月31 31日日PCR原理A瓊脂糖凝膠電泳B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)CLOREM IPSUM DOLORP C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理DNADNA半保留復(fù)制半保留復(fù)制是DNA在進(jìn)行復(fù)制的時候鏈間氫鍵斷裂，雙鏈解旋分開，每條鏈作為模板在其上合成互補鏈，經(jīng)過一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、鏈接酶等）的作用生成兩個新的DNA分子。子代DNA分子其中的一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種方式稱半保留復(fù)制。P C R P C R 原理原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英

2、文全稱：Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction），），簡稱簡稱PCRPCR。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。P C R P C R 原理原理PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫

3、時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。P C R P C R 原理原理PCRPCR工作原理工作原理PCR由變性退火(復(fù)性）延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板模板DNADNA的變性的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060左右，引物與模板DNA單鏈的互補

4、序列配對結(jié)合；引物的延伸引物的延伸：DNA模板與引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。P C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理模板來源模板來源目標(biāo)生物的細(xì)胞，組織，個體等具有活細(xì)胞組織中提取。P C R P C R 原理原理設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度：15-

5、30bp，常用為20bp左右； 引物擴(kuò)增長度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增至10kb的片段； 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 P C R P C

6、 R 原理原理酶，酶，dNTPdNTP（原料）（原料） 公司購買公司購買P C R P C R 原理原理儀器：儀器：P C R P C R 原理原理1、加樣P C R P C R 原理原理 2、PCR瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳脂糖凝膠電泳實驗原理脂糖凝膠電泳實驗原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳法分離瓊脂糖凝膠電

7、泳法分離DNA主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系，因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離，該過程可以通過把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇主要的實驗操作步驟如下： 將完全細(xì)胞培養(yǎng)液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/鏈霉素）放入37水浴鍋中預(yù)熱15-30分鐘。同時將窗鏡臺的紫外打開照射； 將以前凍存在液氮管中的細(xì)胞取出來，快速的放入37水浴鍋中融化，融化期間要不停的輕輕晃動細(xì)胞凍存管，加速細(xì)胞的融化，融化時間大約為2-3min； 將

8、細(xì)胞凍存管用75%的酒精滅菌，然后將細(xì)胞凍存管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個裝有10ml的離心管中，然后用移液槍一滴一滴的加入細(xì)胞培養(yǎng)液，在此過程中不斷輕輕晃動10ml離心管，使其混勻； 將10ml離心管封口，然后放入離心機中，室溫800g，離心時間3min； 將10ml離心管用75%的酒精滅菌，然后放入窗鏡臺中，用吸液器將細(xì)胞培液吸掉，在用新鮮培液將細(xì)胞沉淀輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移至6cm細(xì)胞板中，前后左右輕輕晃動幾下； 將復(fù)蘇好的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6-8小時后換一次培養(yǎng)液（6h后細(xì)胞基本上貼壁），然后繼續(xù)培養(yǎng)。注：每一個拿進(jìn)窗鏡臺的東西都要用75%的酒精擦拭一遍，防止污染細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)

9、胞傳代細(xì)胞傳代一般是當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度為70-90%左右的時候進(jìn)行傳代。主要的實驗操作步驟如下：將完全細(xì)胞培養(yǎng)液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/鏈霉素）、0.25%胰酶以及1xPBS放入37水浴鍋中預(yù)熱15-30分鐘。同時將窗鏡臺的紫外打開照射；用75%酒精擦拭手套、窗鏡臺臺面、細(xì)胞培養(yǎng)液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；將細(xì)胞培養(yǎng)皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出來，放入窗鏡臺中，用吸液器將細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，加入適量的1xPBS，輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)皿；用吸液器將1xPBS吸掉，然后加入適量的0.25%胰酶，然后放入37培養(yǎng)箱消化1-5min，根據(jù)細(xì)胞貼壁性能確定時間；細(xì)胞從壁上消化下來后，用

10、移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使其消化成為單個細(xì)胞，然后加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，終止細(xì)胞消化；將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，然后將15ml離心管轉(zhuǎn)移至離心機中，室溫800g，離心3min；將15ml離心管用75%的酒精滅菌，然后放入窗鏡臺中，用吸液器將細(xì)胞培液吸掉，在用新鮮培液將細(xì)胞沉淀輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移適量比例的細(xì)胞至幾個10cm細(xì)胞板中，前后左右輕輕晃動幾下，使其均勻鋪板；將已經(jīng)傳代好的細(xì)胞放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存首先配置新鮮的凍存液：90%的完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS（FBS可以適量的增加至20%）+5%青霉素與鏈霉素）+10%D

11、MSO（DMSO需要過濾除菌）；凍存步驟和傳代步驟類似，用75%酒精擦拭手套、窗鏡臺臺面、細(xì)胞培養(yǎng)液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；將細(xì)胞培養(yǎng)皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出來，放入窗鏡臺中，用吸液器將細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，加入適量的1xPBS，輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)皿；用吸液器將1xPBS吸掉，然后加入適量的0.25%胰酶，然后放入37培養(yǎng)箱消化1-5min，根據(jù)細(xì)胞貼壁性能確定時間；細(xì)胞從壁上消化下來后，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使其消化成為單個細(xì)胞，然后加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，終止細(xì)胞消化；將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，然后將15ml離心管轉(zhuǎn)移至離心機中，室溫800g，離心3min；將15ml離心管用75%的