經(jīng)典生理生化試驗(yàn)2

1、實(shí)驗(yàn)十九 DNS法及聚酰胺薄膜層析技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)N末端和蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析一、目的：學(xué)習(xí)DNS法及聚酰胺薄膜層析法測(cè)定蛋白質(zhì)N末端和蛋白質(zhì)的氨基酸組成的原理及技術(shù)。二、原理：DNSCl在堿性環(huán)境里蛋白質(zhì)和肽的-氨基酸的氨基起反應(yīng)，生成帶有熒光的、穩(wěn)定的DNS-氨基酸（參看圖19-1，19-2），其反應(yīng)如下：蛋白質(zhì)在水解前與DNSCl反應(yīng)，產(chǎn)生DNS-蛋白質(zhì)，它標(biāo)記在N-末端氨基酸殘基上，經(jīng)水解和薄層層析而測(cè)知是何種氨基酸。蛋白質(zhì)水解后與DNSCl反應(yīng)，標(biāo)記的是蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分，如圖19-1和圖19-2所示。這是一種較為簡(jiǎn)便的、適用的蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分分析的方法。DNS-蛋白質(zhì)水解

2、產(chǎn)物中包括下列DNS-衍生物：相當(dāng)于N-末端的-DNS-氨基酸，從鏈內(nèi)賴氨酸及酪氨酸殘基形成的-DNS-賴氨酸和O-DNS-酪氨酸，這些衍生物相當(dāng)穩(wěn)定。此外，DNSCl還與溶液中的氨起反應(yīng)生成DNSNH2，DNS-磺酰胺以及DNSCl水解生成的DNSOH（DNS-磺酸）。此法與氟二硝基苯法相比，有二個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，即水解產(chǎn)物無需提取，可用電泳或?qū)游龇ㄖ苯予b定氨基酸；另外就是靈敏度高，DNS-氨基酸的最大熒光激發(fā)值約為550nm，由于其熒光十分強(qiáng)烈，15n mol·L-1或0.21.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分別用電泳或薄層層析容易地檢測(cè)。DNSCl能與所有的氨基

3、酸生成具熒光的衍生物。其中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可與DNSCl生成雙DNS-氨基酸衍生物。這些氨基酸相當(dāng)穩(wěn)定，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成的微量分析，靈敏度達(dá)1091010摩爾水平。比茚三酮法高10倍以上，比過去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。DNS-蛋白質(zhì)（或肽），在5.7mol·L-1 HCl，110水解1620h，DNS-蛋白質(zhì)的肽鍵被打開。由于DNS基團(tuán)與氨基之間的鍵結(jié)合牢固，絕大部分DNS-氨基酸都抗水解。除DNS-色氨酸全部被破壞；DNS-脯氨酸（77%），DNS-絲氨酸（35%），DNS-蘇氨酸（30%），DNS-甘氨酸（18%），DNS-丙氨酸

4、（7%）部分被破壞外，其余DNS-氨基酸很少破壞。DNSCl與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)巰基、咪唑基、-氨基和酚反應(yīng)，前兩者在酸堿條件下均不穩(wěn)定，酸水解時(shí)完全破壞；DNS-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩(wěn)定，同時(shí)還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，展層后在層析圖譜的位點(diǎn)上，都與DNS-氨基酸有區(qū)別。DNSCl在pH過高時(shí)，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物DNS-OH，即：在DNSCl過量時(shí)，會(huì)產(chǎn)生DNSNH2，即：DNSOH在紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光，DNSNH2的位點(diǎn)往往和丙氨酸重合，在本實(shí)驗(yàn)條件下，需進(jìn)行第三相展層。根據(jù)鑒定方法需要，DNSCl的濃度5m mol·L-1（約每ml2.0mg丙酮溶液），

5、保存在棕色瓶中，置避光處防止分解。樣品濃度大約1m mol·L-1。反應(yīng)液要求丙酮濃度50%，pH8.59.8，以保證游離氨基等功能團(tuán)非質(zhì)子化。在37保溫，黃色消退即表示反應(yīng)完全，一般約0.5h1h。反應(yīng)完后，混合物中含有較多DNSOH，最好除去副產(chǎn)物后再水解DNS-蛋白質(zhì)或肽。蒸干除去丙酮，加5.7mol·L-1 HCl，抽真空，封管在110水解20h，除去鹽酸，加丙酮溶解點(diǎn)樣展層，在紫外燈下鑒定熒光產(chǎn)物，同標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，可區(qū)分未知DNS氨基酸的種類。根據(jù)氨基酸的種類和數(shù)量可提供被測(cè)蛋白質(zhì)或肽樣品的純度、肽鏈的數(shù)量和N-末端氨基酸的性質(zhì)等方面的有價(jià)值的資料。聚酰胺薄層層析

6、鑒定DNS氨基酸。展層后可鑒定所有的DNS氨基酸。聚酰胺是一類錦綸的化學(xué)纖維原料（或稱尼龍）。由己二酸與己二胺聚合而成的叫作錦綸66：由己丙酰胺聚合而成的叫作錦綸6：聚酰胺薄膜是將錦綸涂于滌綸片上制成，這類聚合物含有大量的酰胺基團(tuán)，所以稱為聚酰胺薄膜。聚酰胺薄膜的酰胺基團(tuán)可與被分離物質(zhì)之間形成氫鍵，因此對(duì)極性物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附作用（圖19-3）。被分離物質(zhì)與酰胺基團(tuán)形成氫鍵能力的強(qiáng)弱，確定了吸附能力的差異。在層析過程中，展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺表面競(jìng)相形成氫鍵，選用適當(dāng)?shù)恼箤尤軇贡环蛛x的各種物質(zhì)在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)有較大差異經(jīng)過吸附與解吸的展層過程，形成一個(gè)分離順序，彼此分開

7、。選擇適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)在5×5cm大小的薄膜上雙向?qū)游?，大部分氨基酸可有效地分開。DNS-氨基酸的分離和鑒定：1溶劑系統(tǒng)第相展層溶劑系統(tǒng)（1）：甲酸（88%）水=1.5100（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（2）：苯冰乙酸=91（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（3）：乙酸乙酯甲醇冰乙酸=2011（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（4）：0.05mol·L-1磷酸三鈉乙醇=31（V/V）2混合標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸圖譜（1）DNS-氨基酸混合樣品，經(jīng)雙向展層后大部分可得到分離（如圖19-4），第相用溶劑（1），第相用溶劑（2）。（2）DNS-天冬氨酸（Asp）和DNS-谷氨酸（Glu）；DNS-絲氨酸

8、（ser）和DNS-蘇氨酸（Thr）；DNS-精氨酸（Arg）和DNS-組氨酸（His）；DNS-賴氨酸（Lys）和DNS-賴氨酸（Lys）可能分不開；DNS-丙氨酸（Ala）和DNS-NH2也可能重疊在一起。為了分離這些DNS化的氨基酸，可用溶劑（3）在第相再展層一次（圖19-5）。（3）經(jīng)過3次展層，有時(shí)，組氨酸和精氨酸，和賴氨酸分離還不完全，可用溶劑系統(tǒng)（4）在第相再展層一次（圖19-6）。3豬胰島素N-末端氨基酸殘基圖譜和氨基酸組成（1）豬胰島素N末端分析（圖19-7）。豬胰島素由2條肽鏈組成，因此，純的豬胰島素有2個(gè)N末端氨基酸，即甘氨酸和苯丙氨酸。還有兩種非N末端的氨基酸，即酪氨酸

9、和賴氨酸。在紫外燈下可見到DNS-Gly和DNS-Phe，同時(shí)還可見到O-DNS-Tyr，-DNS-Lys。（2）豬胰島素氨基酸組成圖譜（19-8）。豬胰島素氨基酸組成包括：Gly，Phe，Leu，Ile，Pro，Val，Ala，Cys，Glu，Asp，Thr，Ser，His，Arg。胰島素氨基酸組成中，Asp和Asn，Glu和Gln是分辨不出來的，因?yàn)榻?jīng)過水解之后，氨基酸的酰胺化合物都轉(zhuǎn)變成為相應(yīng)的酸，Trp（Try）也完全被破壞，測(cè)不出來。測(cè)N-末端時(shí)，如果丹磺?；耆玫截?fù)結(jié)果，則很可能此樣品的N-末端是Trp，因?yàn)門rp的DNS-衍生物鹽酸水解時(shí)全部被分解。丹磺酰化后的肽或蛋白質(zhì)用鏈霉

10、蛋白酶水解，則能很容易地檢測(cè)出Trp。鑒定DNS-氨基酸，可用夾心型的聚酰胺薄板，即板的兩面都涂有聚酰胺薄膜，板的一面點(diǎn)上待檢樣品；另一面點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)樣品。展層后，利用板的透明性鑒定未知DNS-氨基酸。一般情況下，如無這種薄板，則利用所得到的圖與標(biāo)準(zhǔn)的圖譜進(jìn)行比較，有時(shí)還要計(jì)算相對(duì)遷移率，然后才鑒定氨基酸的種類。DNS法鑒定肽和蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸或它們的氨基酸組成是比較方便，也比較靈敏的。但由于聚酰胺薄膜的質(zhì)量不能保證完全一樣，或者展層溶劑系統(tǒng)產(chǎn)生一些細(xì)微變化，這時(shí)所得圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜也會(huì)有差異，這就需要進(jìn)一步證實(shí)差異原因，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。酪氨酸DNS化時(shí)，一般產(chǎn)生3種DNS化產(chǎn)物，即-DNS-Tyr

11、的黃色熒光同一般的DNS氨基酸差不多，而O-DNS-Tyr和di-DNS-Tyr帶有亮黃色熒光。這3種產(chǎn)物展層后分離得比較開（圖19-9）。如果Tyr的DNS化產(chǎn)物和甘氨酸、苯丙氨基酸DNS化產(chǎn)物一起展層，是到如圖19-10的結(jié)果。三、器材及試劑：1器材：紫外燈，恒溫水浴，小型干燥器（或400ml平底燒杯），燒杯，電爐，真空泵，塑料膜，水解管，磨口小試管，毛細(xì)管，聚酰胺薄膜。2試劑：DNSCl丙酮溶液：25mg DNSCl溶在1ml丙酮中，棕色瓶封口，暗處保存，數(shù)月穩(wěn)定。買的商品可能含有一些白色不溶物質(zhì)（水解產(chǎn)物DNSOH），這種物質(zhì)在試劑的保存期間也會(huì)慢慢產(chǎn)生。如果水解程度很少，對(duì)實(shí)驗(yàn)不會(huì)有

12、很大影響（不會(huì)有很大干擾）。0.2mol·L-1 NaHCO3緩沖液（pH9.5）：用Na2CO3和NaHCO3配制（Na2CO3NaHCO3=37）。5.7mol·L-1 HCl：用優(yōu)級(jí)純HCl配制。展層液：第相展層溶劑系統(tǒng)（1）：甲酸（88%）水=1.5：100（V/V）第相展層溶劑系統(tǒng)（2）：苯冰乙酸=91（V/V）四、操作步驟：1丹磺?；夹g(shù)（1）DNS氨基酸制備：用0.2mol·L-1 NaHCO3緩沖液配成2m mol·L-1濃度的氨基酸溶液。取0.1ml加入具塞玻璃試管中，同時(shí)加入0.1ml DNSCl丙酮溶液（2.5mg·ml-

13、1），反應(yīng)要求最終濃度為氨基酸1m mol·L-1，DNSCl5m mol·L-1，丙酮5%（pH8.59.8）。用1mol·L-1 NaOH調(diào)pH910，塞緊搖勻。置37保溫1h，反應(yīng)完成后放暗處保存，備用。（2）多肽和蛋白質(zhì)N-末端DNS化氨基酸溶液的制備：用0.2mol·L-1 NaHCO3溶液配制2m mol/L多肽或蛋白質(zhì)溶液。取0.1ml此溶液加入水解管中，加入0.1ml DNSCl丙酮溶液（2.5mg·ml-1），用1mol·L-1 NaOH調(diào)pH910，混勻后用parlfin封口，置37保溫1h。反應(yīng)完成后，蒸干丙酮，

14、加5.7mol·L-1 HCl，抽真空封口，110保溫1620h，水解完成后，開管將溶液轉(zhuǎn)移到5ml小燒杯內(nèi)，蒸干鹽酸，加幾滴水再蒸干，反復(fù)數(shù)次使鹽酸完全除凈。用丙酮溶解樣品、點(diǎn)樣展層，即可得到樣品的N-末端DNS-氨基酸。（3）多肽和蛋白質(zhì)DNS化氨基酸組成的溶液的制備 水解肽和蛋白質(zhì)：取0.1ml 2m mol·L-1的多肽或蛋白質(zhì)溶液，加入水解管中，再加優(yōu)級(jí)純鹽酸，使鹽酸濃度達(dá)到5.7mol·L-1，抽真空封口，置110水解1620h（最好分別水解24,48,72h），水解完成后，開管轉(zhuǎn)移到5ml燒杯內(nèi)，置沸水浴中蒸去鹽酸，干后加幾滴蒸餾水，繼續(xù)蒸干，反復(fù)數(shù)

15、次除凈鹽酸。 水解氨基酸DNS化：加入0.1ml 0.2mol·L-1NaHCO3和0.1ml DNSCl丙酮溶液，用1mol·L-1 NaOH調(diào)pH910，轉(zhuǎn)移到具塞磨口試管中，置37保溫1h，到此，肽和蛋白質(zhì)DNS化的氨基酸組成的樣品制備完成，即可點(diǎn)樣展層。此法與二硝基化苯相比的優(yōu)點(diǎn)是，水解后無需提取水解產(chǎn)物，可用于電泳或?qū)游龇ㄖ苯予b定氨基酸，且靈敏度高。2以聚酰胺薄層層析鑒定DNS-氨基酸（1）選擇聚酰胺薄膜：聚酰胺薄膜有夾心式（即兩面都涂有聚酰胺的板）和單面聚酰胺薄膜，單面的有4×4cm，7×7cm，5×15cm和7×11cm

16、等幾種規(guī)格。本實(shí)驗(yàn)選用4×4cm或7×7cm均可，并要求質(zhì)地均勻，與尼龍板貼附牢固，無剝脫現(xiàn)象。（2）點(diǎn)樣：將粗細(xì)合適的毛細(xì)管用沙紙或砂輪將較齊的一頭磨平，小心地將樣品點(diǎn)在薄膜的右下角，距離邊緣0.5cm的地方。樣品點(diǎn)要求圓、小，不能把膜觸破，最好一次點(diǎn)樣成功，即在一處只點(diǎn)一下，因此樣品的濃度要合適，如果濃度不夠，則需重復(fù)在一處多次點(diǎn)樣，即在第一次點(diǎn)樣后，用吹風(fēng)機(jī)吹干再點(diǎn)第二次、第三次等，在膜上標(biāo)記。展層第一相樣品在右下角，展層后徹底吹干，將膜順時(shí)針轉(zhuǎn)90°，即樣品原點(diǎn)轉(zhuǎn)到左下角展層第二相。（3）展層 點(diǎn)樣后在小的干燥器里進(jìn)行展層，首先要在干燥器蓋的邊緣涂一薄層凡

17、士林，使之密閉不漏氣，放入培養(yǎng)皿并調(diào)水平。 向培養(yǎng)皿里加入展層劑，溶劑高度不超過3cm，蓋上干燥器蓋，使溶劑蒸汽在干燥器內(nèi)達(dá)到飽和。 用皮筋或線將點(diǎn)好樣的薄膜捆成半圓筒型，并能垂直放穩(wěn)，皮筋不接觸膜，膜在板的內(nèi)面，即光面在外與皮筋接觸。打開干燥器蓋，將捆好的薄膜垂直放入盛有展層劑的培養(yǎng)皿里，立即蓋好蓋，溶劑即向上展層，當(dāng)溶劑上升到離膜頂端0.5cm處時(shí)，停止展層，立即開蓋標(biāo)記前沿，取出，徹底吹干后順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°，以同樣方法進(jìn)行第相展層（用第（2）溶劑系統(tǒng)或根據(jù)需要可在溶劑系統(tǒng)（3）中展層）。五、結(jié)果討論：繪制出層析圖譜，并分析說明該蛋白質(zhì)樣品是由幾條鏈組成？其末端氨基酸是什么？其氨

18、基酸組成如何？六、注意事項(xiàng)：1制備的條件在DNS-氨基酸制備時(shí)，DNS化必須在堿性條件下（pH9.710.5）進(jìn)行，否則會(huì)有很多副產(chǎn)物DNSNH2或DNSOH產(chǎn)生。測(cè)蛋白質(zhì)或肽的N-末端氨基酸時(shí)，可用透析或Sephadex G-25，G-15，G-10層析，除去DNS-OH和DNS-NH2及小分子物質(zhì)再水解。2封管水解的幾個(gè)問題（1）DNS化后，加5.7mol·L-1 HCl水解，一定要抽真空封管。否則110水解時(shí)易氧化破壞氨基酸。（2）水解后一定要把HCl徹底除凈。3點(diǎn)樣展層（1）點(diǎn)樣：樣品的點(diǎn)要小、圓、量要適當(dāng)，否則拖尾，因此毛細(xì)管要細(xì)，頭要平，樣品濃度要合適，聚酰胺薄膜要選擇優(yōu)

19、質(zhì)的。（2）展層要在小的、密閉的、底部水平的容器里進(jìn)行，每次展層的溫度、時(shí)間、展層劑的濃度要保持一致，否則不易重復(fù)。4鑒定未知樣品的N-末端氨基酸（1）內(nèi)標(biāo)法確定未知樣品N-末端氨基酸：在一塊薄膜上點(diǎn)未知的DNS-氨基酸，第二塊膜上點(diǎn)已知標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸，第三塊膜上將未知的和已知的同時(shí)點(diǎn)在一點(diǎn)上，展層后觀察，如果在第三塊膜的熒光加強(qiáng)并重合，表明此未知氨基酸同已知標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸一樣，否則為不同的氨基酸。（2）采用夾心型的聚酰胺薄膜，其膜的兩面都涂有聚酰胺，可在一側(cè)面點(diǎn)上待測(cè)的DNS-氨基酸；另一側(cè)面點(diǎn)上對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸。層析后可利用板的透明性質(zhì)，比較、鑒定未知的DNS氨基酸。思 考

20、 題1DNS化測(cè)定N-末端的根據(jù)是什么？DNS化的最適pH值是多少？采用什么緩沖體系？2DNS化的副產(chǎn)物是什么？如何除去？3DNSCl除能與-氨基反應(yīng)外，還能與氨基酸的什么基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，生成什么產(chǎn)物？4未知樣品（蛋白質(zhì)或肽）的N-末端氨基酸如何確定？實(shí)驗(yàn)二十 聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)一、目的：學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的原理及方法。二、原理：等電點(diǎn)聚焦（isoelectric focusing, IEF）或簡(jiǎn)稱電聚焦（electrofocusing），也曾稱等電點(diǎn)分離聚焦電泳等。它是60年代中期出現(xiàn)的技術(shù)，克服了一般電泳易擴(kuò)散的缺點(diǎn)。近年來，等電點(diǎn)

21、聚焦電泳又有了新的進(jìn)展，可以分辨等電點(diǎn)只差0.001pH單位的生物分子。由于它的分辨力高、重復(fù)性好、樣品容量大、操作簡(jiǎn)便、迅速，在生物化學(xué)、分類學(xué)、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究等諸方面，都得到廣泛應(yīng)用。等電點(diǎn)聚焦電泳產(chǎn)生pH梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩沖液相互擴(kuò)散，在混合區(qū)形成pH梯度，此為人工pH梯度。這種pH梯度不穩(wěn)定，常用于制備電泳；另一種是利用載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下形成自然pH梯度。本實(shí)驗(yàn)就是利用載體兩性電解質(zhì)形成的自然pH梯度進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品等電焦聚電泳的。理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)該在其本身的等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力和良好的導(dǎo)電性，且分子量要小，組成與被分析樣品有所區(qū)別，對(duì)分

22、析樣品無變性作用或發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。常用的載體兩性電解質(zhì)是一系列脂肪族多氨基和多羧基類的混合物，即是一系列的異構(gòu)物和同系物，分子量在3001000之間，各組分的等電點(diǎn)(pI)既有差異又相接近，pI的范圍在2.511之間。合成載體兩性電解質(zhì)的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反應(yīng)如下：R1和R2為氫或帶有氨基的脂肪基。這一反應(yīng)的特點(diǎn)是生成眾多的異構(gòu)物和同系物的混合物，而不是均一的化合物?；旌衔镏懈鞒煞值暮俊⒌入婞c(diǎn)的分布，取決于原材料的性質(zhì)、比例和合成條件。目前常用的載體兩性電解質(zhì)的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司

23、），近來已有國(guó)產(chǎn)商品了。不同廠家合成的方法不同，電泳的條件也略有不同。目前，載體兩性電解質(zhì)商品在使用時(shí)還存在一些問題，如樣品中的鹽濃度對(duì)pH梯度有影響等，但畢竟優(yōu)點(diǎn)很多，仍然得到廣泛應(yīng)用。 分析載體兩性電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)可知，它既有酸性基團(tuán)(NH)，也有堿性基團(tuán)(COO)，既可接受分子，也可釋放質(zhì)子：它們?cè)谒嵝詶l件下帶正電荷，在堿性條件下帶負(fù)電荷。當(dāng)它們所帶的正負(fù)電荷相等時(shí)，其凈電荷為零，呈電中性，此時(shí)溶液的pH值為該兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)，以pI表示。所以兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)在數(shù)值上等于它呈電中性時(shí)溶液的pH值。等電點(diǎn)是反映兩性電解質(zhì)在溶液中得失質(zhì)子的能力，是它的物化性質(zhì)。兩性電解質(zhì)在溶液中的行為可以從

24、兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質(zhì)。如溶液是pH7，對(duì)pI=9的兩性電解質(zhì)來說，是處于酸性環(huán)境，故帶正電荷；但對(duì)pI=3的兩性電解質(zhì)來說，卻是處于堿性環(huán)境，故而帶負(fù)電荷。所以，不同pI的兩性電解質(zhì)，在同一環(huán)境中帶有不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質(zhì)又破壞了水的解離平衡：使溶液pH有所改變。當(dāng)某一兩性電解質(zhì)pI較低，即釋放質(zhì)子（H+）能力較強(qiáng)，使溶液pH值下降，這類兩性電解質(zhì)稱為酸性兩性電解質(zhì)；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質(zhì)。所以，在溶液中的兩性電解質(zhì)一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質(zhì)；另一方面，它又影響周圍環(huán)境（水溶液），使其pH值有所改

25、變。載體兩性電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分布在2.510之間。在制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，將其混溶其中。電泳時(shí)凝膠板正極的電極液是磷酸，負(fù)極是氫氧化鈉。正極是酸性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)都帶正電荷，但由于pI的不同，其所帶正電荷數(shù)量就有所差異電泳時(shí)負(fù)極泳動(dòng)的速度也就因此不同。同理，負(fù)極是堿性環(huán)境，載體兩性電解質(zhì)帶有數(shù)量不等的負(fù)電荷，以不同速度向正極泳動(dòng)。根據(jù)兩性電解質(zhì)的特性，在泳動(dòng)過程中又不斷地與溶液交換質(zhì)子，改變了溶液的pH。當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即得失質(zhì)子相等，不再出現(xiàn)質(zhì)子的交換時(shí)，載體兩性電解質(zhì)到達(dá)等電點(diǎn)并各處于自己的pI區(qū)域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈現(xiàn)不同的pH，隨載

26、體兩性電解質(zhì)的pI梯度而形成pH梯度。由于凝膠的防對(duì)流擴(kuò)散作用，使pH梯度保持穩(wěn)定不變（參看圖20-1）。實(shí)驗(yàn)操作中，要求開始電泳時(shí)恒壓60V，15min，目的在于使小分子的，泳動(dòng)快的載體兩性電解質(zhì)可在短時(shí)間內(nèi)形成一個(gè)粗略的pH梯度。此后，恒流為8mA，是為了避免電泳開始時(shí)介質(zhì)中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。當(dāng)各種蛋白質(zhì)逐漸泳動(dòng)到各自等電點(diǎn)位置時(shí)，帶電顆粒逐漸減少，出現(xiàn)電阻增大，電壓隨之增高現(xiàn)象。當(dāng)電壓升到550V時(shí)，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恒壓到580V，繼續(xù)電泳120min后，蛋白質(zhì)顆粒慢慢地集中到它等電點(diǎn)位置。電流接近于零時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒不再泳動(dòng)，電泳也到此結(jié)束。蛋白質(zhì)

27、樣品也因其等電點(diǎn)的差異而得到集中和彼此分開（參看圖20-2）。最早的等電聚焦電泳是垂直板式，后來發(fā)展為水平板式。超薄層水平板式也是近幾年發(fā)展起來的，這種形式的電泳的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省兩性電解質(zhì)試劑、加樣數(shù)量多、利于比較不同樣品的電泳結(jié)果，而且電泳后的固定、染色和干燥都很方便、迅速。水平板式等電聚焦電泳的最大優(yōu)點(diǎn)是防止了由于電極液的電滲作用而引起pH梯度的漂變。三、器材及試劑：1器材：穩(wěn)流穩(wěn)壓電源，水冷式平板等電聚焦電泳電槽，玻璃板（11.5×11.5×0.2cm），大鐵文具夾，塑料模具（厚0.5mm，中間開孔9.0×9.0cm），小眼科剪子，鑷子，解剖刀，1ml注射器，5

28、0l和100l微量注射器，擦鏡紙，濾紙，精密pH試紙，凝血板，培養(yǎng)皿（120mm），脫脂棉，棕色試劑瓶，吸液管，吸耳球，玻璃紙，坐標(biāo)紙。2試劑：重蒸水，丙烯酰胺（重結(jié)晶），甲叉雙丙烯酰胺（重結(jié)晶），過硫酸銨，TEMED（四甲基乙二胺），載體兩性電解質(zhì)（pH3.510），考馬氏亮藍(lán)R250，液體石臘，乙醇（95%），硅油，磺基水楊酸，三氯乙酸，甲醇，乙酸（36%），已知pI蛋白質(zhì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦樣品（市售），磷酸，氫氧化鈉。3溶液配制：（1）單體貯液：丙烯酰胺2.91g，甲叉雙丙烯酰胺0.9g，重蒸水溶解，定容到100ml，過濾備用（在棕色瓶中4可保存兩周）。（2）電極液：陽極1mol

29、3;L-1磷酸（H3PO4）：原磷酸試劑的濃度約為16mol·L-1，故配制時(shí)用重蒸水稀釋16倍即可。陰極 1mol·L-1氫氧化鈉（NaOH）：稱取4g固體溶于100ml重蒸水中。（3）固定液：甲醇35ml，三氯乙酸10g，磺基水楊酸3.5g加水定容到100ml。（4）染色液：乙醇35ml，冰乙酸10ml，考馬氏亮藍(lán)R2500.1g加水定容到100ml，溶解后過濾備用。（5）脫色液：乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。（6）保存液：甘油15ml，乙醇25ml，冰乙酸10ml，加水定容到100ml。（7）樣品：牛血清蛋白 1mg·ml-1，糜蛋白酶

30、元A 1mg·ml-1，肌紅蛋白 1mg·ml-1，卵清蛋白 1mg·ml-1，標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦樣品。（8）大鼠肌肉提取液：1g鼠肌肉，加水5ml，勻漿提取，離心取上清液透析備用。（9）10%過硫酸銨：稱1g溶在10ml重蒸水中（純過硫酸銨溶解時(shí)會(huì)有響聲）。四、操作步驟：1凝膠配制單體貯液2.0ml，重蒸水5.3ml，載體兩性電解質(zhì)0.6ml，真空抽氣15min后加TEMED（原液）8l和10%過硫酸銨60l，混勻立即灌膠。2灌膠（1）準(zhǔn)備 取3mm洗凈晾干的玻璃板，涂上一層薄薄的防水硅油，以重蒸水沖洗，使硅油分布均勻。 平板電泳槽調(diào)水平，電泳槽上放上一張濾紙。 濾紙

31、上放一厚2mm的玻璃板，玻璃板上面放上塑料模具（參看圖20-3（a）。 用文具夾將模具和玻璃板固定在平板電泳槽上。 在模板上面，文具夾的另一端再放上涂有硅油的玻璃板。（2）灌膠：小心、迅速地將混勻的膠灌到模具的框內(nèi)。灌膠時(shí)膠液沿著上面有硅油的玻璃板的一端即文具夾的另一端，向文具夾方向推進(jìn)，邊灌膠邊推上面的玻璃板，使模具框內(nèi)充滿膠液，框內(nèi)不能有氣泡，為趕走氣泡可移動(dòng)玻璃板，待氣泡釋放后再向前進(jìn)，一直推到接觸文具夾，使兩塊玻璃把膠封在框內(nèi)，模具框內(nèi)充滿膠液，切不可有氣泡，否則要重新制膠和灌膠（參看圖20-3(b)）。在正式灌膠之前調(diào)水平之后，以8ml水代替膠液練習(xí)灌膠，直到不產(chǎn)生氣泡為止。操作熟練

32、后，洗凈玻璃板、模具、晾干備用。抽氣后再加TEMED和過硫酸銨，混勻后迅速灌膠。過硫酸銨溶液要新鮮，必須當(dāng)天配制。（3）去掉上面的玻璃板和模具：灌膠后室溫靜止1h，在模具和膠的邊緣可觀察到折光，這是膠已凝固的特征。再老化0.5h，然后小心將兩塊玻璃打開，凝膠和模具會(huì)自然地貼附在其中一塊玻璃板上，去掉上面的模具及凝膠板周圍的和滲出邊緣的殘膠，即可作加樣準(zhǔn)備。3加樣、電泳（1）加樣前準(zhǔn)備 在電泳槽上涂一層液體石臘，再鋪一張方格坐標(biāo)紙（點(diǎn)樣時(shí)作定位用）。用一塑料片刮去電泳槽與坐標(biāo)紙之間的氣泡，并使坐標(biāo)紙浸透石臘。 將帶膠的玻璃板放至涂有石臘的坐標(biāo)紙上面，趕走氣泡。 接通冷凝水，再調(diào)一次水平。 鋪電極

33、條：將1cm寬、9cm長(zhǎng)的3層濾紙條浸透電極液（陽極用磷酸1mol·L-1，陰極用氫氧化鈉1mol·L-1）后，放在另一張濾紙上吸干面上的電極液，用鑷子將電極條鋪在凝膠兩端，輕壓電極，使電極條和膠貼緊，一定要平直，多余部分剪去，膠面上的殘液用濾紙吸凈（參看圖20-3（d）。（2）加樣 取8層擦鏡紙重疊在一起，剪成約紙5×5mm小塊，浸透樣品，放在離電極1cm以外的膠面上。PI6以下的樣品置于負(fù)極附近，pI6以上樣品位于正極附近，貼緊。微量標(biāo)準(zhǔn)樣品可少幾層擦鏡紙或直接加樣在膠面上。根據(jù)玻璃板下坐標(biāo)紙所顯示的格子，自由選擇待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品放置的部位。 壓好電極板，蓋好蓋子，接通冷凝水，再調(diào)一次水平（參看圖20-3（c）。（3）電泳 開始：恒壓60V，15min后，恒流8mA，電泳時(shí)電壓不斷上升，直到電壓升為550V時(shí)，關(guān)電源。 開蓋去掉加樣紙，以免紙上殘留的樣品在染色時(shí)干擾結(jié)果的判斷。 調(diào)節(jié)電源，恒壓580V