草芽孢桿菌的液體發(fā)酵及其產(chǎn)物中糖化酶的實(shí)驗(yàn)

1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào) 姓名 學(xué)院 專業(yè)、班級(jí) 實(shí)驗(yàn)課程名稱 枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵及其產(chǎn)物中糖 化酶的活性測(cè)定教師及職稱 開課學(xué)期 2013 至 2014學(xué)年 下 學(xué)期 云南師范大學(xué)教務(wù)處編印一 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)名稱枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵及其產(chǎn)物中糖化酶的活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)間2013.4.7-2013.4.14實(shí)驗(yàn)室130（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)(1) 發(fā)酵罐主體(2) 蒸汽滅菌系統(tǒng)：正確把握各閥門的操作(3) 通氣系統(tǒng)(4) 加熱冷卻循環(huán)系統(tǒng)：各管道聯(lián)絡(luò)關(guān)系(5) 攪拌動(dòng)力系統(tǒng)(6) 智能控制系統(tǒng)2. 掌握發(fā)酵罐小試的基本操作，包括：培養(yǎng)基配制，滅

2、菌，接種，參數(shù)設(shè)定3. 掌握發(fā)酵過程中的參數(shù)測(cè)定和在線控制，包括：pH，DO，溫度，攪拌速度，生物量，產(chǎn)物生成量，消泡，CO2。4. 運(yùn)用所學(xué)發(fā)酵工程基本理論分析發(fā)酵過程中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，討論根霉的發(fā)酵規(guī)律。（二）實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖1、實(shí)驗(yàn)原理液體發(fā)酵的概念 液體發(fā)酵技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)之一，它是指在生化反應(yīng)器中，模仿自然界將食藥用菌在生育過程中所必需的糖類、有機(jī)和無機(jī)含有氮素的化合物、無機(jī)鹽等一些微量元素以及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解在水中作為培養(yǎng)基，滅菌后接入菌種，通入無菌空氣并加以攪拌，提供食用菌菌體呼吸代謝所需要的氧氣，并控制適宜的外界條件，進(jìn)行菌絲大量培養(yǎng)繁殖的過程。工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵培

3、養(yǎng)即為發(fā)酵生產(chǎn)，亦稱深層培養(yǎng)或沉沒培養(yǎng)。工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)必需采用發(fā)酵罐，而實(shí)驗(yàn)室中發(fā)酵培養(yǎng)多采用三角瓶。得到的發(fā)酵液中含有菌體、被菌體分解及未分解的營(yíng)養(yǎng)成分、菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵液直接供作藥用或供分離提取，也可以作液體菌種。 枯草芽孢桿菌簡(jiǎn)介1.1生理特性枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞 0.70.8×23微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨

4、酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖。 1.2作用機(jī)理1、枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用； 2、枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長(zhǎng)； 3、刺激動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力； 4、枯草芽孢桿菌菌體自身合成-淀

5、粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用； 5、能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。1.3應(yīng)用范圍 枯草芽孢桿菌不僅在飼料中應(yīng)該比較廣泛,在污水處理及生物肥發(fā)酵或發(fā)酵床制作中應(yīng)用也相當(dāng)廣泛,是一種多功能的微生物. 1、 市政和工業(yè)污水處理，工業(yè)循環(huán)水處理，腐化槽、化糞池等處理，畜牧養(yǎng)殖動(dòng)物廢料、臭味處理，糞便處理系統(tǒng)，垃圾、糞坑、糞池等處理。 2、 畜牧、家禽、特種動(dòng)物及寵物養(yǎng)殖，水產(chǎn)養(yǎng)殖。 3、可以與多種菌種混配，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用；（如：JT菌種）MBS菌株：在畜禽養(yǎng)殖中使用益生菌不僅可避免長(zhǎng)

6、期使用抗生素所引起的腸道微生態(tài)平衡被破壞、 產(chǎn)生耐藥性及藥物殘留等問題 ,還能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和免疫力?？莶菅挎邨U菌能改善腸道微生態(tài)環(huán)境 ,促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高抗病力 ,而且分泌各種消化酶類 (如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶和纖維素酶等 ) ,促進(jìn)養(yǎng)分的消化、 吸收 ,更重要的是枯草芽孢桿菌在不利環(huán)境條件下能形成芽孢 ,在飼料制粒、 貯存及胃酸環(huán)境中仍能保持較高活性。因此 ,枯草芽孢桿菌比其他有益微生物有著更多的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的研究和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)流程：蒸汽管空氣滅菌裝料通入蒸汽對(duì)物料加熱排空冷空氣冷卻、接種通風(fēng)比和控制參數(shù)按要求進(jìn)行培養(yǎng)。鏡檢裝置示意圖：蒸氣附屬設(shè)備下游處理空氣附屬設(shè)備 蒸汽蒸汽蒸

7、汽1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料設(shè)備：小型發(fā)酵罐的構(gòu)造 小型發(fā)酵罐是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)研究的必備裝置，如上圖所示為小型發(fā)酵罐、主要由罐體、通氣系統(tǒng)、攪拌系統(tǒng)、加熱及控溫系統(tǒng)、監(jiān)測(cè)及控制系統(tǒng)等幾個(gè)部分組成。 1.罐體 罐體是發(fā)酵生產(chǎn)微生物菌體或代謝產(chǎn)物的場(chǎng)所，一般由不銹鋼、陶瓷或特種玻璃制成，其體積根據(jù)需要可從0.1升到100升不等。L1523型發(fā)酵罐的體積為19升。由罐蓋、罐體和罐底）組成。 （1）罐蓋：由耐腐蝕的不銹鋼構(gòu)成，其上有十二個(gè)圓孔，分別用于安裝pH探頭、溫度探頭、溶解氧探頭、氣壓表、調(diào)節(jié)pH的補(bǔ)酸、補(bǔ)堿管、排氣管過濾器、通氣管、放樣管和安全閥，靠近外側(cè)的兩個(gè)孔一般用塞子塞住，主要用于接種、加

8、消泡劑等。 （2）罐體：由耐高溫、高壓的特種玻璃制成，其內(nèi)有各種探頭、通氣管、放樣管、攪拌器（圖6）和擋板等。 （3）罐底：由具夾層的不銹鋼制成，夾層內(nèi)與加熱器和冷卻水聯(lián)通，通過此夾層與發(fā)酵罐進(jìn)行熱交換，以控制罐內(nèi)溫度。攪拌器也是通過罐底進(jìn)入罐體的，稱為下攪拌，此外在罐底還有空氣分布器，能使壓縮空氣均勻分布于發(fā)酵罐中。 2.通氣系統(tǒng) L1523型發(fā)酵罐適用于好氣性微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，其空氣來源于空氣壓縮機(jī)。由空壓機(jī)壓縮的高壓空氣經(jīng)除油、除水和減壓裝置減壓后，通過預(yù)先滅菌的空氣過濾器過濾除菌，然后再經(jīng)空氣分布器、攪拌器和擋板等的共同作用，使無菌空氣均勻地分布到整個(gè)發(fā)酵罐。 3.攪拌系統(tǒng) 發(fā)酵罐的攪

9、拌裝置可分為上攪拌和下攪拌兩種類型，L1523型發(fā)酵罐屬于下攪拌，其攪拌器由攪拌電機(jī)驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)速高達(dá)1000rpm。 4.加熱與控溫系統(tǒng) L1523發(fā)酵罐為原位滅菌發(fā)酵罐，利用自帶的小型加熱器(鍋爐，)，可進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌和保溫，再借助于冷卻水(自來水)可使發(fā)酵罐內(nèi)的滅菌溫度和發(fā)酵溫度精確 地保持恒定(誤差為±0.1)。 5.監(jiān)測(cè)及控制系統(tǒng) 小型發(fā)酵罐一般都配備有監(jiān)測(cè)控制系統(tǒng)，可以監(jiān)測(cè)和控制攪拌器的轉(zhuǎn)速、滅菌和發(fā)酵的溫度、pH值、溶解氧量等。L1523型發(fā)酵罐可通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，中間可 借助蠕動(dòng)泵和補(bǔ)料系統(tǒng)自動(dòng)補(bǔ)料和調(diào)節(jié)pH值等。 材料：培養(yǎng)基、枯草桿菌2 實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)

10、1. 斜面菌種的培養(yǎng) 將已活化兩次的試管斜面菌種接種到試管斜面上，30培養(yǎng)1820小時(shí)，即為斜面菌種。 2.三角瓶種子的培養(yǎng) 將試管斜面用4.5ml無菌水洗下，然后接種到250ml三角瓶培養(yǎng)基中，每瓶一管，接三瓶，于30，150rpm條件下，振蕩培養(yǎng)1820小時(shí)（一級(jí)種子）。由三角瓶移接入另外500ml三角瓶（或更多的250ml三角瓶）中擴(kuò)大培養(yǎng)（此為二級(jí)種子），保證二級(jí)種子接種量7-10%（如13L發(fā)酵液則為910-1300ml左右，其中還包括預(yù)留一部分作標(biāo)準(zhǔn)曲線用）3.發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌 每組配制13L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳膠管小心地加入發(fā)酵罐中，

11、然后旋緊塞子，安裝好防護(hù)罩（見圖7），按下面的方法滅菌： （1）檢查水、電、氣以及發(fā)酵罐的密封性是否正常。如正常即可滅菌。 （2）打開進(jìn)水閥，調(diào)節(jié)水壓使水壓表指針指示在0.20.4之間，使水充滿加熱器，防止燒壞加熱器。（出水閥近關(guān)閉情況下，達(dá)到0.4，此時(shí)出水閥雖然關(guān)閉，但進(jìn)水閥打開，此外水壓也滿足要求，所以水能充滿加熱器不至于燒壞，當(dāng)滅菌結(jié)束降溫時(shí)，熱水會(huì)走另一條旁路（非出水閥的另一條出口）泄壓。） （3）打開發(fā)酵罐的總電源。（4）打開攪拌器的電源開關(guān)，使攪拌器轉(zhuǎn)速控制在300rpm，培養(yǎng)時(shí)根據(jù)要求調(diào)整。 （5）適當(dāng)開啟排氣口排氣，但應(yīng)注意：排氣口不能開得過大，否則，培養(yǎng)基的水分損失嚴(yán)重！

12、（6）打開溫度控制器的電源開關(guān)，將滅菌溫度設(shè)定為121，滅菌時(shí)間設(shè)定為30min，發(fā)酵溫度設(shè)定為30。啟動(dòng)滅菌開關(guān)，進(jìn)行自動(dòng)滅菌。 注意：1.滅菌過程中決不能離開人！應(yīng)隨時(shí)觀察發(fā)酵罐有無異常情況，如出現(xiàn)異常應(yīng)及時(shí)請(qǐng)教師處理或關(guān)閉總電源。 2.發(fā)酵罐的玻璃不能接觸冷水！ 3.發(fā)酵罐滅菌參數(shù)已經(jīng)設(shè)置好，未經(jīng)教師允許，不得隨意改動(dòng)！ （7）滅菌結(jié)束后，發(fā)酵罐會(huì)自動(dòng)降溫，當(dāng)溫度低于95時(shí)，通過無菌操作，安裝好已滅菌的空氣過濾器，（即關(guān)上門窗，解開繩子，放好95%酒精在安裝孔的周圍，關(guān)上進(jìn)氣口，開大出氣口，保證極低正壓以保安全和防止雜菌落入罐內(nèi)，先旋松螺蓋，點(diǎn)燃95%酒精，在火上操作裝上空氣過濾器。工具

13、有：尖嘴鉗、鑷子、95%和75%的酒精）然后，通入無菌空氣，使培養(yǎng)基快速降溫，并使發(fā)酵罐保持一定的正壓，以減少污染。 （8）當(dāng)溫度低于35時(shí)即可接種發(fā)酵。（操作同（7）里類似 ） 4.接種 在發(fā)酵罐的罐蓋上選擇一個(gè)塞子，先用75%的酒精棉球在其周圍消毒，同時(shí)消毒尖嘴鉗，然后在塞子周圍放置吸滿無水酒精的棉花，點(diǎn)燃酒精，用鉗子小心打開塞子，取出置于火焰上，將三角瓶種子按5%的接種量迅速倒入發(fā)酵罐內(nèi)，旋緊塞子。 5.發(fā)酵 在滅菌達(dá)到121時(shí)校正溶氧電極的讀數(shù)為零，接種后當(dāng)溫度達(dá)到培養(yǎng)溫度、攪拌速度穩(wěn)定、通氣量穩(wěn)定時(shí)，校溶氧電極至95%以上。 攪拌速度設(shè)定為350rpm，發(fā)酵溫度設(shè)定為28，開始計(jì)時(shí)發(fā)

14、酵。發(fā)酵時(shí)間根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)情況而定，一般約70小時(shí)。 發(fā)酵過程中，應(yīng)注意： （1）溶解氧的斜率一般不得低于50%，否則需加大攪拌速度或適當(dāng)增大通氣量。 （2）發(fā)酵過程中，應(yīng)經(jīng)常觀察并記錄發(fā)酵罐內(nèi)部的變化情況，如泡沫過多，應(yīng)及時(shí)消泡。消泡方法是采用無菌操作技術(shù)，打開發(fā)酵罐蓋頂?shù)囊粋€(gè)塞子，加入消泡劑（豆油），每次用量視具體情況而定（20或30ml），但每批次發(fā)酵最多不超過400ml。 （3）發(fā)酵過程中應(yīng)及時(shí)記錄發(fā)酵參數(shù)的變化情況。 發(fā)酵結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)的清洗發(fā)酵罐和實(shí)驗(yàn)用品。 注意：發(fā)酵罐體不能用鹽酸清洗。 6.繪制枯草桿菌的生長(zhǎng)曲線 發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，從0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、

15、16、18、20、24、26、28、30、小時(shí)，分別取樣測(cè)定發(fā)酵液的O.D.值，繪制出枯草桿菌的生長(zhǎng)曲線。 7.枯草桿菌的鏡檢 發(fā)酵接種以后，12，24，36，每隔12小時(shí)芽孢染色鏡檢一次，觀察芽孢和菌體情況確定是否可罐內(nèi)是否談判雜菌污染。5 思考題：固態(tài)發(fā)酵的特點(diǎn)與液體發(fā)酵比？ 1、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中沒有游離水的流動(dòng)，適宜于水活度在0.930.98的微生物生長(zhǎng)，限制了應(yīng)用范圍，同時(shí)也限制了某些雜菌的生長(zhǎng)。 2、營(yíng)養(yǎng)物濃度存在梯度，發(fā)酵不均勻，菌體的生長(zhǎng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌存在不均勻。 3、固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)基提供的與氣體的接觸面積大，供氧充足，同時(shí)，空氣通過固體層得阻力較小，能量消耗低。 4、使用固體原料，在發(fā)酵過程中，糖化和發(fā)酵過程同時(shí)進(jìn)行，簡(jiǎn)化操作工序，節(jié)約能耗。 5、高底物濃度可以產(chǎn)生高的產(chǎn)物濃度。 6、由于產(chǎn)物濃度高，提取工藝簡(jiǎn)單可控，沒有大量有機(jī)廢液產(chǎn)生，但提取物含有底物成分。 7、生產(chǎn)機(jī)械化程度較低，缺乏在線傳感儀器，過程控制較困難二實(shí)驗(yàn)報(bào)告1實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果1、鏡檢 通過堿性染料對(duì)枯草桿菌進(jìn)行染色，觀察枯草桿菌的生長(zhǎng)狀況和檢驗(yàn)是否有雜菌污染。取菌液，并固定取片，擦拭干凈鏡檢堿性染料，染色10s后用清水沖洗2對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論1、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)鏡檢看到的單細(xì)胞較少，視野中多為細(xì)胞團(tuán)塊，此外，還有明顯的細(xì)胞碎片。2、由于條件有限，實(shí)驗(yàn)室僅有一臺(tái)倒