纖維素酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀

1、纖維素酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀 摘要：主要探討了近年來纖維素酶的研究進(jìn)展。重點(diǎn)概述了纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用、來源以及菌種研究現(xiàn)狀，并對該領(lǐng)域的研究問題和前景進(jìn)行討論。關(guān)鍵詞：纖維素酶、應(yīng)用降解、結(jié)構(gòu)功能、制備1 引言 纖維素類物質(zhì)占全球球植物總干重的30% 50% 1，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物。對人類而言，它又是自然界中最豐富的一種可再生資源。據(jù)報(bào)道，我國的纖維素類資源極為豐富，僅秸稈和皮殼每年可達(dá)7×108 噸。但是這些物質(zhì)的利用率很低 ，多采用燃燒的方法處理，這樣不僅造成了環(huán)境污染 ，也是資源和能源的巨大浪費(fèi)。使用纖維素酶可以把天然纖維素物質(zhì)

2、降解為可利用的糖液， 再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酒精、氣體燃料(如氫氣 )等物質(zhì)，這對解決我國乃至世界的糧食短缺、能源危機(jī)、環(huán)境污染等問題具有深遠(yuǎn)的意義2。此外，纖維素酶還在食品、釀造 、紡織 、造紙、飼料、石油開采等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。2 纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)和功能1906年Selliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)了纖維素酶。纖維素酶(Cellulase)是指能水解一1，4一葡萄糖苷鍵，使纖維素降解成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單一酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系。纖維素酶是由葡聚糖內(nèi)切酶(EC3214，也稱Cx酶 )、葡聚糖外切酶(EC32191，也稱 C1 酶)、一葡萄糖苷酶(EC2121，也

3、稱BG酶或纖維二糖酶)三個主要成分組成的誘導(dǎo)型復(fù)合酶系。C1酶和Cx酶主要溶解纖維素，BG酶主要將纖維二糖、纖維三糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，當(dāng)三個主要成分的活性比例適當(dāng)時，就能協(xié)同作用完成對纖維素的降解3。絕大多數(shù)纖維素酶包括一個催化功能域和一個（或者多個）碳水化合物結(jié)合功能域，并由一個可識別的連接橋（linker）連接而成。3 纖維素酶的降解作用機(jī)理     目前 ，纖維素酶分解纖維素的分子機(jī)制大致有3種假說4：改進(jìn)的 C1一Cx假說、順序作用假說和競爭吸收模型。這些學(xué)說都認(rèn)為，纖維素酶降解纖維素時，先吸附到纖維素表面，然后其中的EG(內(nèi)切酶) 在葡聚

4、糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物產(chǎn)生寡聚糖 ，CBH(外切酶)從葡聚糖鏈的非還原端進(jìn)行水解產(chǎn)生纖維二糖 ，CB水解纖維素二糖為葡萄糖 ，在整個降解過程中，纖維素降解菌中的這3類酶“協(xié)同作用”最終完成對纖維素的降解 。2000年 ，Ute Heinze等5用酶法和化學(xué)法對帶有 230羧甲基的纖維素降解特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)纖維素的降解具有功能區(qū)域選擇性 。2003年 ，Shawn DMansfield6等研究糞肥桿菌(Celhdomonas fimi)中單一組分的纖維素酶在纖維素降解 中的作用時發(fā)現(xiàn) ，單個纖維素酶的作用是獨(dú)立的，而不同酶分子之間的作用是相互補(bǔ)償?shù)?。4 纖維素酶的應(yīng)用4.1 食品工業(yè)纖維素

5、酶在食品加工中應(yīng)用十分廣泛。人們通常食用是植物性農(nóng)副產(chǎn)品的細(xì)胞內(nèi)容物，細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素、果膠等。適當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理植物性原料，可以使細(xì)胞壁發(fā)生不同程度的改變，如軟化、膨脹、崩潰，從而改變了細(xì)胞的通透性，提高細(xì)胞內(nèi)含物的提取率。在果蔬加工中，一般需要對果蔬原料進(jìn)行預(yù)處理 ，若采用纖維素酶處理，不僅可以避免熱燙、酸堿處理等造成的營養(yǎng)物質(zhì)損失還可以使果蔬組織軟化膨松，提高消化性和口感。將纖維素酶用于果蔬汁加工可提高汁液的提取率，促進(jìn)汁液澄清。萬日余等7將纖維素酶用于草莓汁生產(chǎn) ，使出汁率提高92，草莓汁中糖分增加2，壓榨時間縮短 5min。Novo nordisk公司將復(fù)合纖維

6、素酶用于蘋果汁加工，使出汁率提高525，生產(chǎn)能力也大幅度增加8 。纖維素酶在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的應(yīng)用研究主要在醬油釀造和制酒業(yè)。纖維素酶用于醬油釀造 ，可以改善醬油質(zhì)量，縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)量9。在釀酒過程中添加纖維素酶可提高出酒率，其原因可能是 ：纖維素酶分解原料中部分纖維素，主要產(chǎn)物葡萄糖可供酵母利用，同時，纖維素酶分解了植物細(xì)胞壁，利于淀粉的釋放和利用。尚維等10將纖維素酶用于清香型優(yōu)質(zhì)白酒的生產(chǎn)中，結(jié)果使出酒率提高 13，且不影響酒的品質(zhì)。邱雁臨11用纖維素酶處理啤酒糟，可使啤酒糟的蛋白酶解率提高 10以上。使用纖維素酶可提高活性物質(zhì)的提取率。馬長清等12采用纖維素酶水解法提取香菇柄和香菇

7、蓋中的多糖和氨基酸，結(jié)果表明，香菇柄加酶的提取液中多糖的含量增加 54，香菇蓋增加 44，香菇柄加酶的提取液中氨基酸含量增加 10，香菇蓋增加 15。傅博強(qiáng)等13噪用低溫水提、纖維素酶提二次結(jié)合法提取茶多糖，與水提法相比，酶提法的多糖和粗多糖的提取率分別增加 633和989，多糖總提取率達(dá) 297，粗多糖(于重)總提取率達(dá) 793。4.2 飼料工業(yè)畜禽飼料中含有大量的纖維素物質(zhì)，除了反芻動物可依靠瘤胃微生物利用纖維素外 ，其它畜禽很少能利用纖維素。若在飼料中添加纖維素酶不僅可以提高飼料的利用率和消化率 ，還可以提高畜禽的生產(chǎn)性能。蘇輝14在奶牛精料中添加50g纖維素酶 ，提高了飼料的

8、消化率、利用率，產(chǎn)奶量增加。同時，還能降低奶牛消化道的發(fā)病率。Yang等15在對泌乳期的荷斯坦牛飼以纖維水解酶。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蘇輝的研究結(jié)果一致。李蒙等16用纖維素酶、酵母菌處理玉米秸稈飼喂育肥羊，平均日增重提高了413g，減少精料用量 871。在養(yǎng)豬業(yè)中，申瑞玲等17在生長育肥豬(體重約 20kg)10苜蓿粉日糧中添加 005、01、015的復(fù)合纖維素酶飼糧。結(jié)果表明，生長育肥豬 2040kg體重階段和體重 40kg以后，復(fù)合纖維素酶添加水平分別為 015、01，有利于提高生長育肥豬的生產(chǎn)性能。在養(yǎng)雞業(yè) 中，王懷凡等18在蛋雞 丑糧中添加 01纖維素酶，使產(chǎn)蛋率提高 108，蛋重提高 17

9、，料蛋比下降 146。劉小平19在肉雞日糧中添加 015纖維素酶，結(jié)果使平均耗料量 降低 32，每千克增重 的飼料消耗量降低1 11，死亡率降低 32。4.3 在洗滌劑工業(yè)中堿性纖維素酶在洗滌劑工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。洗滌劑中加入堿性纖維素酶可以降解衣物表面的一些細(xì)小的纖維，使附著在衣物上的一些頑固性污跡被洗脫下來，從而避免 衣物經(jīng)反復(fù)穿戴洗滌后出現(xiàn)的陳舊感。另外，堿性纖維素酶一般不具有外切葡萄糖苷酶活性，不能作用于結(jié)晶纖維素，因此即使經(jīng)過反復(fù)洗滌，棉麻織物的強(qiáng)度和表觀聚合度均不會發(fā)生顯著的改變20。4.4 紡織業(yè)纖維素酶在紡織業(yè)中的應(yīng)用十分廣泛。采用纖維素酶處理牛仔布不僅可以達(dá)到

10、傳統(tǒng)石磨法整理的效果，而且可以克服石磨法整理的缺點(diǎn) ，加工后的牛仔布雪花點(diǎn)多 、立體感強(qiáng)、 色光好、酶洗工藝條件溫和、耗能降低 ，大大減少了服裝與設(shè)備的磨損。纖維素酶還可用于棉織物的生物拋光整理，增加棉織物的光潔度和柔軟度21。 4.5 其它方面22在造紙業(yè)中，纖維素酶可用于廢紙脫墨、處理造紙廢料、改善紙張性能等方面。此外 ，纖維素酶在石油開采 、可降解塑料業(yè) 、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。5 纖維素酶的來源及菌種研究現(xiàn)狀5.1 來源纖維素酶的來源非常廣泛，昆蟲、微生物、細(xì)菌、放線菌、真菌、動物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。目前，纖維素酶的生產(chǎn)主要有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方法，其

11、工藝如下：固體發(fā)酵法：是以玉米等農(nóng)作物秸桿為主要原料通過接種微生物來進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵設(shè)備簡單 ，投資少，產(chǎn)品價格低廉 ，但發(fā)酵水平不穩(wěn)定 ，生產(chǎn)效率低，易污染雜菌，勞動強(qiáng)度大。液體發(fā)酵：生產(chǎn)丁藝過程是將玉米秸稈粉碎至 20目以下，滅菌處理后，送入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，同時接入纖維素酶菌種 ，發(fā)酵時間約為 70h，溫度低于 60C，并從發(fā)酵罐底部通入凈化后的無菌空氣對物料進(jìn)行氣流攪拌，發(fā)酵完畢后物料經(jīng)壓濾機(jī)壓濾、超濾濃縮和噴霧干燥后得到纖維素酶產(chǎn)品。液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)條件易控制，生產(chǎn)效率高 ，不易染雜菌 ，勞動強(qiáng)度小，適于大規(guī)模生產(chǎn) 。5.2 菌種研究現(xiàn)狀自發(fā)現(xiàn)纖維素酶100年來 ，人們通過不懈地努力，從

12、土壤 、溫泉 、油井 、堆肥 、朽木 、反芻動物體內(nèi)分離到了比較多的分解纖 維素 的微生物 ，木酶是分解纖維素的最好微生物 。所有菌株產(chǎn)生的纖維素酶主要是Cx酶 、C1 酶和一葡萄糖苷酶三種酶 。纖維素酶的測定方法目前采用的是纖維素酶羧甲基纖維素 (CMC)測定法 ，纖維素酶濾紙酶活 (FPA)測定法 ，纖維素酶濾紙崩潰的測定法 ，纖維素酶還原糖測定法和一葡萄糖苷酶測定法。人們發(fā)明了通過水解圈大小判定高產(chǎn)酶菌株方法。 目前采用的誘變方法主要是15W 的紫外線(UV)燈30 cm處照射出發(fā)菌株3 min左右 ；在出發(fā)菌株溶液里加 01 molL NaN02溶液2 ml，誘變510 min；紫外線

13、 一 亞硝酸復(fù)合誘變 ；射線( 60Co)誘變 ，以 650Gy劑量照射出發(fā)菌株幾分鐘 ；紫外線 (Uv)誘變5 min后 ，再用1硫酸二乙酯 (DES)誘變40 min；將出發(fā)菌株涂布平板 ，脈沖注入20×l0 N cm 作離子誘變等 。經(jīng)誘變育 種 ，現(xiàn)代生物技術(shù)的遺傳改造和優(yōu)化培養(yǎng)條件 ，篩選到了產(chǎn)酶 能力強(qiáng) 、酶活高 、適應(yīng)性好 、不受酶解產(chǎn)物的反饋抑制的大量變異菌株 。纖維素酶基因大小在1 500 bp左右 ，部分菌株的產(chǎn)酶基因 (如外切型纖維素酶基因 cbh2，內(nèi)切型纖維素酶基因egl、eg4)被克隆、測序并可以整合到畢赤酵母的染色體上獲得表達(dá) 。還可把它們構(gòu)建在一些不受

14、葡萄糖抑制的真核啟動子下游 ，使酶不再受到培養(yǎng)基中葡萄糖影響而得到 高效表達(dá) ，從而 促進(jìn) 其他纖維素酶基因的協(xié)同表達(dá) ，可較大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力。6 問題及展望目前燃料乙醇的生產(chǎn)原料以糧食為主，消耗大量的糧食，而隨著國家退耕還林政策的實(shí)施 ，全國糧食產(chǎn)量在近期內(nèi)很難增加，如長期使用高粱、玉米等糧食作物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，可能不利于我國糧食供應(yīng)安全。近二三十年來 ，利用纖維素進(jìn)行高效生物降解的研究已經(jīng)展開，雖然在纖維素菌株的選育、纖維素酶組分及降解機(jī)制、纖維素酶合成的調(diào)節(jié)與調(diào)控以 及纖維素酶應(yīng)用等諸多分支課題都取得了重要進(jìn)展 ，但迄今尚未找到一種微生物或酶來有效利用

15、纖維素這一巨大的可再生資源 。近年來隨著以分子克隆為基礎(chǔ)的基因工程技術(shù)的快速發(fā)展與日趨成熟 ，國內(nèi)外研究者已開始應(yīng)用重組DNA技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)對纖維素酶進(jìn)行改造，以構(gòu)建新的纖維素高效降解工程菌。以生物化學(xué)理論作依據(jù)，采用蛋白質(zhì)工程方法，構(gòu)建具有可完全降解結(jié)晶纖維素的纖維素酶分子，同時結(jié)合底物預(yù)處理等技術(shù)，使其能在生物反應(yīng)器中高效和重復(fù)使用，也是實(shí)現(xiàn)纖維素高效降解得到燃料酒精的重要途徑。相信在不久的將來，利用纖維素降解菌高效降解纖維素生產(chǎn)燃料酒精終將成為現(xiàn)實(shí) 。 參考文獻(xiàn)：1 鄒儀明植物纖維素化學(xué)(第二版)M北京：中國輕工業(yè)出版社 ，19951521 54 2徐昶 ，等高產(chǎn)

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