氨基酸的紙層析

1、氨基酸的紙層析一、 實驗?zāi)康?、 了解紙層析法的使用原理。2、掌握用紙層析法分離蛋白質(zhì)的操作步驟。 二、 實驗原理1、 紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析方法，濾紙上的纖維具有羥基，是親水基團，濾紙吸附水作為固定相，其上流經(jīng)的有機溶劑即展層劑作為流動相。當(dāng)展層劑流經(jīng)固定相時，固定相上的樣品由于親水、疏水能力不同，在兩相之間不斷分配，疏水能力強的多溶于流動相，隨流動相移動距離較遠(yuǎn)，親水能力強的移動距離則較近。2、 所有的氨基酸的碳上均連接一個氫原子和兩個親水基團羧基（COOH）與氨基（NH2），唯一的不同則在于R基團。因此R基團在氨基酸的親水疏水能力對比中起到了決定性的作用。本實驗采用脯氨

2、酸、甘氨酸，苯丙氨酸，組氨酸，其親水疏水能力迥異，能在濾紙上明顯分開。 分配系數(shù)K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度3、 Rf值表示原點中心至顯色斑點中心的距離與原點中心至流動相前沿的距離比。在一定條件下，Rf值為定值，其影響的因素有物質(zhì)本身的性質(zhì)，溶劑的性質(zhì)，PH值，溫度，濾紙的性質(zhì)等等，本實驗不予探究。在測量原點中心至顯色斑點中心的距離時，由于斑點的形狀不規(guī)范（近似圓形），所以，一般取斑點的重心，測量出重心與起點的距離即可。4、 顯色原理：茚三酮在弱堿性溶液中與氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氧，脫羧反應(yīng)，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用生成紫色物質(zhì)。三、 試劑1. 酸性層

3、析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2<V/V>2. 顯色儲備液：0.4mol/L茚三酮異丙醇：甲酸：水=20：1：5<V/V>3. 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、組氨酸His）4. 未知樣品液：上述四種氨基酸中的一種或幾種混合液（每組任選一樣品）四、 實驗儀器樣品管 毛細(xì)吸管層析缸 100ml量筒50ml燒杯 膠頭滴管 移液管 濾紙：15cm*15cm *1 鉛筆 直尺 保鮮膜 細(xì)玻璃棒 電吹風(fēng) 薄膜手套五、 操作步驟 （一）展層劑和平衡溶劑的配制 1在100ml燒杯中按照體積比 正丁醇：88%甲酸：蒸餾水=15：3：

4、2的比例配制展層劑，建議為45ml：9ml：6ml。 2取1ml顯色貯備液混于展層劑中 3將混合好的液體放于層析缸中，混勻密閉，靜置（展層缸洗凈后應(yīng)除去多余的水，否則會影響展層溶劑的比例而影響展層。 （二）點樣（點樣操作應(yīng)戴上手套，防止樣品和濾紙受污染）1實驗臺上鋪好保鮮膜，保鮮膜下面可以蘸少量水，使得保鮮膜能與實驗臺面緊密貼合，此后所有操作都在保鮮膜上進行，不再贅述。2在距平行于15cm長的邊2cm處用鉛筆輕輕描出一條直線，此為展層起點線，在直線中間每隔2.53cm用鉛筆輕輕點一個點，共點6個點。 3將毛細(xì)管的一端在酒精燈外焰上灼燒36s，毛細(xì)管管口變細(xì)即可。 4用毛細(xì)管分別蘸取四個氨基酸標(biāo)

5、準(zhǔn)液和待測液，點樣于展層起點線的六個點上。點完一次后，用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干，再點第二次樣。每次點樣均要求斑點半徑（一般直徑不超過5mm）。 5在標(biāo)準(zhǔn)樣下面用鉛筆做好標(biāo)記，記錄該點的氨基酸名稱。（三）平衡及展層 1將點好樣的濾紙兩側(cè)邊緣對齊但不接觸，卷成筒形，并用訂書機訂34次，將圓筒固定。 2將圓筒豎直放入層析缸中，濾紙勿與缸壁接觸，蓋上蓋子（點樣點的一端在下，展層劑液面需低于點樣線1cm左右） 3待溶劑前沿線距濾紙末端12cm（展層長度10cm，約2小時）時取出濾紙（需戴上手套）用鉛筆將前沿線作一標(biāo)記。剪去縫合線，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干（通風(fēng)櫥進行），即可見層析斑點。 （四）顯色及Rf值計算 1取出烘完

6、的濾紙，估計出斑點的重心，并用鉛筆輕輕點出。 2用直尺測量出斑點中心到展層起點線的距離以及展層液跑出的距離，計算Rfx=（x=1，26）3將混合樣分離出的斑點的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)樣的進行對比，從而認(rèn)清各斑點的氨基酸種類，并在濾紙上標(biāo)明。 六、 注意事項1. 實驗全程戴一次性薄膜手套，全套實驗在鋪在實驗臺上的薄膜上進行。原因：人的皮膚上含有含氮化合物，而實驗臺上可能未洗干凈殘留其他氨基酸，會沾染到濾紙上，對實驗產(chǎn)生影響；保鮮膜可以與鐘罩邊緣進行更緊密的結(jié)合，是平衡效果更好。2. 用毛細(xì)吸管進行點樣時，為保證點樣半徑足夠小，應(yīng)使毛細(xì)管內(nèi)的液體高度低于1cm，迅速的點在濾紙上。若管內(nèi)液體過高，可以先將毛細(xì)

7、管的液體點一部分于干凈的衛(wèi)生紙上，降低管內(nèi)液體高度。3. 在通過移液管添加展層劑時，液體應(yīng)緩慢放出，避免濺射到濾紙上，移液管拿出時也應(yīng)該注意不要碰觸濾紙。4. 展層開始時不要使樣品浸入展層劑中。5. 吹風(fēng)機吹干時切記用冷風(fēng)吹干，以免溫度過高使氨基酸變性。七實驗結(jié)果 樣品號：A06Rf（Pro）=4.1/9.90.414Rf（Phe）=6.45/10=0.645Rf（Gly）=2.40/10.10.237Rf（His）=1.60/10.40.154Rf（6上）=7.20/10.60.679Rf（6中）=4.70/10.60.443Rf（6下）=2.60/10.60.245Rf（7上）=7.30/10.50.695Rf（7中）=4.70/10.50.447Rf（7下）=2.80/10.50.267樣品中含有的成分是脯氨酸、苯丙氨酸和甘氨