真核生物的啟動子

1、真核生物的啟動子由于真核生物中有三種不同的 RN臊合酶，因此也有三種不同的啟動子，其 中以啟動子II最為復雜，它和原核的啟動子有很多不同：（1）有多種元件：TATA 框，GCf, CATT!, OCT?; （2）結(jié)構(gòu)不恒定。有的有多種框盒如組蛋白 HB; 有的只有TATAM和GCH,如SV4W期轉(zhuǎn)錄蛋白，（3）它們的位置、序列、距 離和方向都不完全相同，（4）有的有遠距離的調(diào)控元件存在，如增強子；（5） 這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點的作用；（6）不直接和RNApol結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合。（一）II類基因的啟動子和調(diào)控區(qū)II類基因的啟動子由核心元件

2、和上游元件組成。核心元件包括TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點附近的啟始子（initiator , Inr ）。在起始點一般沒有同源序列，但 mRNA勺第一個堿基傾向A,另一側(cè)翼由Py 組成（在原核啟動子的CAT起始序列也有這種情況），稱為起始子（initiator ）, 一般由PY2CAP5構(gòu)成，位于-3+5,可能提供RNA pol II識別。無論TATA是否 存在，Inr對于啟動子的強度和起始位點的選擇都是十分重要的?，F(xiàn)已分離純化了與Inr特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。1 .核心元件TATAM合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚語稱為金磚（Goldbrick ）,其一致序列是：T8

3、5A9T93A5A33A83A50,常在起始位點的上游-25左 右，相當于原核的-10序列。但-10是不可缺少的，而真核啟動中也有的缺乏 TATA 框。其作用是：（1）選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始，故也稱為選擇子（selector ）,當有的基因缺少TATA®時，可能由Inr來替代它的這一作用， 如鼠的脫氨核甘轉(zhuǎn)移酶（Tdt）基因就沒有TATA框，1有17bp的Inr ; （2）影 響轉(zhuǎn)錄的速率。TATA框的8bp的保守序歹一般者B是由A.T對組成，少數(shù)情況在 其中的兩個位點上由G.C對取彳t了 A.T,可見它是較容易打開。當它的序列因發(fā) 生突變和缺失而改變時就會影響它和酶的

4、結(jié)合能力，從而影響轉(zhuǎn)錄的能力。在伴 清蛋白基因中，當TATAlf突變?yōu)門AGAt,轉(zhuǎn)錄效率大大降低。兔的珠蛋白基因 當TATA框的保守序列ATAAA欣工突變?yōu)锳TGTAA寸轉(zhuǎn)錄效率會下降80%人的P 珠蛋白基因的ATAAA?列變?yōu)锳TGAA或ATAG/CAA珠蛋白產(chǎn)量也會大大降低而 出現(xiàn)地中海貧血癥。2 . 上游啟動子元件（UPE）上游元件包括CAATbox、GCbox、等，它們的保守序列和結(jié)合的蛋白質(zhì)因子 也各不相CAAT box的保守序列是GGCTCAATC廣股位于上游-75bp左右緊靠-80 ,其 功能是控制轉(zhuǎn)錄起始活性。能和 CTF （識別CATT勺轉(zhuǎn)錄因子）相結(jié)合。GCbox的保守序

5、列是 GTGGGCGGGGCAAT多拷貝形式存在-90處。在真生 物和病毒的一些啟動子中常存在 GCI,如鼠二氫酸葉酸還原酶啟動子，猴基因 組中的雙向啟動子，SV40， 皰疹病毒等基因的啟動子中， 可被轉(zhuǎn)錄因子 SPI 所識別。它的作用也是控制轉(zhuǎn)錄效率。還有其它的一些 UPE如八聚體（Octamer） , KB, ATF等3 遠端調(diào)控區(qū)（1） 增強子遠端調(diào)控區(qū)較常見的是增強子（enhomcer）。至少在有時候增強子的存在可以增強啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。它是在1981 年由 Benerji,Rusconi 小組和 Chambom等發(fā)現(xiàn)的，又稱遠上游序列（far upstream seguence）。其

6、特點是： 具有遠 距離效應。常在上游-200bp 處，但可增強遠處啟動子的轉(zhuǎn)錄，即使相距十幾 Kb也能發(fā)揮其作用； 無方向性。無論在靶基因的上游，下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增 強轉(zhuǎn)錄的作用； 順式調(diào)節(jié)。只調(diào)節(jié)位于同一染色體體上的靶基因，而對其它 染色體上的基因無作用； 無物種和基因的特異性，可以接到異源基因上發(fā)揮 作用，如將SV40的增強子接到兔&珠蛋白基因前，引入Lela細胞，此珠蛋白 基因轉(zhuǎn)錄增強200倍。 具有組織的特異性。SV40的增強子在3T3細胞中比 多瘤病毒的增強子要弱，但在 Hela細胞中SV40的增強子比多瘤病毒的要強5 倍， 抗體基因的增強子只有在B 淋巴細胞中才起作用。

7、增強子的效應需特定的蛋白質(zhì)因子參與。 有相位性。其作用和DNA勺構(gòu)象有關(guān)。 有的增強子可以對 外部信號產(chǎn)生反應。 如熱體克基因在高溫下才表達。 編碼重金屬蛋白的金屬硫蛋白基因在鎘和鋅存在下才表達。某些增強子可以被固醇類激素所激活。病毒SV40的增強子是最先被描述的，它由2個72bp的重復序列組成。位于 上游-200bp處。每個72bp的單元中都有A B兩個功能域。它們在一起共含有5 個序列元件（GTI , GTI, Sph.11,sphI和P）,這5個元件對轉(zhuǎn)錄來說是很重要 的。 不同的序列模塊是作為特殊轉(zhuǎn)錄因子識別序列。 增強子的某些結(jié)構(gòu)特征和啟 動子相似：如它們都是被反式一作用因子（ rt

8、ams-acting factors ）所識別的順 式-作用序列（ cis-acting seguence ），只不過增強子的作用距離比啟動子長。增強子為什么具有遠距離作用呢？為了解這個問題前后曾有三種不同的假設：（ 1）拓樸效應；（2）滑動模型；（3）成環(huán)模型。拓樸效應說認為增強子的作用是誘導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使核小體產(chǎn)生DNasel敏感區(qū)。SV40的增強子區(qū)和免疫球蛋白基因的增強子區(qū)都發(fā)現(xiàn)存在DNasel的高敏感區(qū)。增強子區(qū)域核小體常不能很好裝配，結(jié)構(gòu)松馳；在 SV40的增強子區(qū)域存在左旋的Z-DNA區(qū)，也 有助于雙螺旋的打開，使和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)因子和DNA吉合，然后再延著DNA滑向啟動子

9、； 成環(huán)模型認為增強子通一些蛋白質(zhì)因子的介導可與遠距離的啟動子結(jié)合，使DNA成了一個環(huán)，從而促使遠距離的啟動子的轉(zhuǎn)錄。這一模型已得到普遍的認可。一些實驗的證據(jù)表明免疫球蛋白 K鏈基因的增強子可以作用兩個距 離不同的啟動子 （分別為440bp 和 2.7Kb） ， 而作用是相同的。 若是按滑動模型，對距離的啟動子的作用應高于遠距離的啟動子。 但事實并非如此。 從消耗能量的 角度來說， 這距離的滑動對生物是不利的， 在進化中會受到選擇的壓力。 成環(huán)模 型也符合染色體的側(cè)環(huán)模型和核基質(zhì)的調(diào)控理論（見第十七章）也就是說DNA的特殊序列可以和核基質(zhì)結(jié)合形成側(cè)環(huán)， 在某些細胞中某些基因通過環(huán)的形成命 名樣

10、強子區(qū)和啟動子區(qū)相互靠近， 使這些基因能得以表達， 而另一些基因， 顯示 了基因表達的組織特異性?？磥憝h(huán)的形成主要是兩種因素：（a）某些蛋白質(zhì)因子的介導； （b） 和核基質(zhì)特異的結(jié)合圖。 （ 2）減弱子（dehancer ）在某些基因的上游遠端或下游遠端具有負調(diào)節(jié)序列， 其作用不受距離和方向的影響，叫做減弱子。如 C-mos基因上游0.8或1.8Kb處有一序列，使C-mos 不易被反轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復序列（LTR）所激?So在C-myc基因的3'端也 存在著減弱子。(3) 靜息子( sisencer )在酵母交配型轉(zhuǎn)換的盒式模型中，左右兩個沉默框(HM你口 HMFR1 17, 23章

11、)都不表達，此是由于在這兩個框盒上游1.5Kb處都有一個E片段，它可和阻 遏沉默框盒表達的蛋白 SIR (1-4) ( silent mating tyne information regulation )結(jié)合，起抑制作用，故稱靜息子，可作用 2.5Kb遠的啟動子。(4) 上游激活序歹U ( upstream activating seguences UASs )UAS加酵母中遠上游序列類似于增強子。 它僅影響轉(zhuǎn)錄程度，對位點選擇不 起作用。和增強子不同的是它有方向性， 不能在啟動子的下游起作用。它結(jié)合的 轉(zhuǎn)錄因子是GCN本口 GAL4識另1J位點為ATGACTCAT(二)RNA pol II

12、的轉(zhuǎn)錄起始第一步是原稱為TFH D的轉(zhuǎn)錄啟動因子和TATAI1結(jié)合形成復物體，為 RNA pol II指明結(jié)合位置?，F(xiàn)在已和 TFH D含有種蛋白，一種是識別TATA®的TBP (TATA-binding protein ),是 30KDa的小蛋白。另一些亞基稱為 TAFs (TBP 結(jié)合因子，TBP-associated factors )。有的TAFs是和TBP等當量的。而另一 些TAFs存在量較少。很可能TFH Ds含有不同的TAFs來識別不同的啟動子。這種觀點認為TB可口不同的TAFs結(jié)合可以使其它的聚合酶識別啟動子。TFIHB是用于內(nèi)部polm啟動子，SLi是用于polI啟

13、動子，但這兩者都被分成 TBP 和特殊TATs結(jié)合的一種成份。任何單個的TBP分子，其本身并不是對所有啟動 子都是必需的。但實際是和TAFs結(jié)合，不斷地用于特殊的啟動子。TBP必需具 備在各種啟動子上和這種因子或聚合酶相互作用結(jié)合的能力。在酵母中TBP基因 突變性會影響到不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。人類口型基因的轉(zhuǎn)錄因子因子分子量功能RNAPoln>10K依賴模板合成RNATFU A12, 19, 35K穩(wěn)定TFn D和DNA的結(jié)合，激活 TBP亞基TFU B33K結(jié)合模板鏈(-10+10),起始Pol n結(jié)合，和TFn E/F相互作用TFU D(TBP, 30K)TBP亞基識別TATA將聚合

14、酶組入復合體中，TAFs識別特殊啟動子TFU E34K(曲57K( a)結(jié)合在Pol n的前部，使復合體的保護區(qū)延伸到下游TFU F38, 74K大亞基具解旋酶活性(RAP74，小亞基和Pol n結(jié)合，介導其加入復合體TFU H具激酶活性，可以磷酸化 Pol n C端的CTQ使Pol n逸出，延伸TFU I120K識別Inr ,起始TFn F/D結(jié)合TFU JTFn S在TFn F后加入復合體，不改變DNA的結(jié)合方式RN蛤成延伸TBP作為第一個和DN肱觸的因子十分引人注目，有是它被看成是一種“束縛”因子(commitment factor )其實是和 RNA pol II結(jié)合，使啟動子轉(zhuǎn)錄，它

15、 起到介導的作用。由于TATAI1離轉(zhuǎn)錄起始位點的距離是固定的，識別它對RNA聚合酶來說是重要的。TBP在啟動上對各種聚合酶所起的一個相同的作用是將它 們組入轉(zhuǎn)錄復合體中。TFH A含有幾個亞基(在酵母中有2個，在哺乳動物中有3個)，當它加入 復合體中時，TFII D所保護的DNAK域就延伸更上游的區(qū)域。它可能通過解除TAFs 的阻遏作用而激活TBP，它的參與使TFII D和TATAI1結(jié)合得更穩(wěn)定TFII B分子量為33Kda,它在起始點鄰近區(qū)域，從-10至"10可以部分地保護 模板鏈在TATAI下游與DNA公散結(jié)合。形成復合物，和 DN敬鏈結(jié)合是不對稱 的，它還可以使TFII日H

16、F相互作用。TFn F含有2個亞基，大亞基RAP74具有ATp -依賴性DNAB旋酶活性，它 和起始時DNA!的熔解有關(guān)。它的小亞基是RAP38和細菌的6因子有部分同源， 緊密地和RNApol II結(jié)合。介導pol II和其它蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄成復合體。TFII F-pol II和復合體連接時，與TFII B的相互作用是重要的。RNA Polll結(jié)合位點在模板鏈上達到下游+15,在非模板鏈上達到+20,其長 度貫穿了整個復合體，上游也被其保護了。TRU E結(jié)合在pol的前部，使復合體的保護區(qū)延伸到下游雙鏈的 +30處。TRU H和TRHJ在TRU F之后也加入復合體中，但并不改變DNA勺結(jié)合方式。T

17、FII H具有激酶活性，可以磷酸化RNAool II尾巴上的CTD CTD的磷酸化使pol II從轉(zhuǎn)錄因子中釋放出來，這樣就能離開啟動子開始延伸。這一起始過程和細菌RNA pol催化的反應是相似的。RNA pol的結(jié)合產(chǎn)生了 閉合復合體。在最后階段雙鏈打開產(chǎn)生開放復合體。這種轉(zhuǎn)變是和下游位點復合 體體影響的增加有關(guān)。多半是由于 TFR因子的釋放有關(guān)。起始反應的雙鏈分離階段是需水平解ATP的，可能要釋放某些轉(zhuǎn)錄因子。在基本的因子和pol R的相互作用中看來TBP和酶尾部的CTD之間的作用也是重要的。在沒有TATAI1的啟動子上起始何發(fā)生呢？這種起始同樣需要一些基本的轉(zhuǎn) 錄因子，其中也包括TFH

18、Do TFH D可能帶有一個或多個TAFs來直接識別Inr , 并與之結(jié)合。現(xiàn)在還不清楚在和 TATA吉合中TFH D怎樣發(fā)揮其作用。Inr序列 可能作為一種位置元件，讓轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于其上，且錨這種復合體。TFn D看來必須以某種其它方式進入復合體而不結(jié)合在TATA框上。在這些啟動子上TBP的功能很象在pol的啟動子上和polm的內(nèi)部啟動子上。很多的基本因子含有多種亞基，所以多數(shù)的分子量是很大的，可能涉及到約20多種肽，總分子量達到500KDa pol II約有10個亞基分子量也有約500Kda, 看來 RNA Pol 的起始是涉及到非常大的復合體。Pol II起始復合體提供了一個和原核轉(zhuǎn)錄有

19、趣的對照。細菌的RNA pol很容易和DNAg合；6因子對于起始于必要的，但無助于延伸，因起始后它就被釋放 出來了。真核的pol R只有在起始因子和DN閣合后才和啟動子結(jié)合。這些因子 的作用類似6因子，使聚合酶識別啟動子上的特殊序列。但已進化得比較獨立。 (三)RNA pol I啟動子RNA pol I的啟動子變化最小，RNA pol僅從單一類型的啟動子轉(zhuǎn)錄rRNAX 因，轉(zhuǎn)錄本含有大rRNAs和小rRNAs的序列，經(jīng)過加工再將它的釋放出來。這種啟動子描述得最清楚的是人類細胞中的，它由兩部分序列構(gòu)成，一是核心啟動子( core promoter )或核心元件( core element )，位

20、一起始位點的前后， 從-45 到+20， 負責轉(zhuǎn)錄的起始。另一部分是上游控制元件( upstream,controlelement UCE) ， 它從 -180 延伸到 -107 ， 此區(qū)可增加核心元件的轉(zhuǎn)錄起始的效率。這兩個區(qū)域都有一個特殊的成份，就是 G.C豐富區(qū)(G.C含量達85%。RNA pol I需要2種輔助因子：UBF1(上游結(jié)合因子1)結(jié)在核心動子相關(guān) 的特異序列中和UCELk。SL1因子，它本身對這種啟動子來說并非是特異的，但 一旦UBF1和DN閣合了，那么聚合酶才能和核心啟動子結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄。很可能 是這些因子結(jié)合在核心啟動子上直接與 RNA poll相互作用，但還不清楚在 U

21、CE 上的因子如何刺激核心啟動子的起始。在 RNApol II啟動子中遠距離作用是一 個重要的特點，研究得較為深入，但不知道RNApol I是否具有相同的機制。UBF1是一個單鏈多肽，它可以和核心區(qū)UCE勺G.C豐富區(qū)結(jié)合。UBF1和RNApol可在異源模板上發(fā)揮功能，如鼠的這種蛋白質(zhì)因子和pol I能識別人類的基因。但 SL1 在起始轉(zhuǎn)錄時具有種的特異性。LS1含有4個蛋白，其中之一稱TBP；也是pol II和polm起始時所需的一種 蛋白質(zhì)因子。 可能在聚合酶起始后不久就發(fā)揮作用。 這一和 pol 有關(guān)的重要特點 是TBP在種間是保守的，但似乎并不具有種的特性，也并不一定要特異地和G.C豐

22、富區(qū)結(jié)合。因此可能和DNA勺結(jié)合的種白特異性是SL1另一些組分的功能。TBP 可能和 RNA pol 相互作用，和RNA pol 的一個共同的亞基或一個功能域相結(jié)合。SL1 的行為與細菌的因子相似，作為復合體的一個成員，若分開來的話，它單獨是不能和啟動子特異結(jié)合的。 但和其它組分結(jié)合起來就可以結(jié)合在啟動子的特異區(qū)域。其初步功能可能是保證RNA5合酶能位于起始位點的合適位置上。簡 而言之其功能是使TBP和其它蛋白質(zhì)結(jié)合，為pol II和polm提供轉(zhuǎn)錄因子。三種 聚合酶起始的共同特點是依賴 TBP和蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成的一種“位置”因子，這種 位置因子對不同類型的啟動子來說是特異的。非洲爪蟾的 pol

23、 I 啟動子并不分兩個區(qū)域，它從+1 到-141 ，其序列具備高度的種的特性，RNApol I在體外只能從密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄rRNA基因。種的特異性是由轉(zhuǎn)錄因子決定的。(四)Pol m啟動子的結(jié)構(gòu)及起始人們通過轉(zhuǎn)錄起始區(qū)不同位點的缺失或突變來研究各種啟動子的結(jié)構(gòu)和功能。RNApolm啟動子一般分成基因內(nèi)啟動子和基因外啟動子兩類它們是由不同 的轉(zhuǎn)錄因子以不同的方法來識別的。5s RN所口 tRNA都屬于RNA pollH啟動子，但它們比較特殊，位于起始位點的下游的轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，因此也稱為下游啟動子( downwtreampromoter )或基因內(nèi)啟動子( intragenenic promo

24、ter )或稱為內(nèi) 部控制區(qū)(internal contron regin ,ICR )。snRNA基因的啟動子和常見的啟 動子一樣位于起始位點的上游， 在以上兩種不同的情況中都有特序列存在， 這些 序列由轉(zhuǎn)錄因子識別而并不直接和 RNA合酶結(jié)合。正是這些構(gòu)成了特殊的pol m啟動子。在非洲爪蟾的5s RNA基因啟動子在未鑒別出前，人們都以為它在起始位點 的上游，缺失分析表明，當上游序列全部被切除后5SRNA勺產(chǎn)物仍照樣合成。當 缺失在基因內(nèi)發(fā)生時仍可轉(zhuǎn)錄，只不過產(chǎn)物也缺少一段。但缺失發(fā)生在+55 區(qū)域時，就不再轉(zhuǎn)錄。因此可以推測啟動子位于起始點下游 +55,可能由于pol加起 始轉(zhuǎn)錄要有一個

25、固定的距離。當缺失發(fā)生在基因末端，但保留80bp序列時轉(zhuǎn)錄不受影響。但當缺失發(fā)生在80bp區(qū)域轉(zhuǎn)錄就會停止，表明啟動子的下游分界域 在+80。因此5SRNA勺啟動子是在基因中的+55+80之間。含有這個區(qū)域的DNAt段 就可在其上起始轉(zhuǎn)錄，起始點在+55的更上游的位置。用突變分析表明有兩種類型的內(nèi)部啟動子，每一種都由兩部分構(gòu)成。這是兩 個短的序列元件中問問隔著一個可變化的序列。比較一下這兩種類型的內(nèi)部啟動子表明：I型內(nèi)部啟動子含有兩個分開的 boxA (口 G G C N N AG T - G句) 和boxC (C G G T C G A-N N C C )序列。而II型內(nèi)部啟動子含有兩個分開

26、的 boxA和boxB。II型內(nèi)部啟動子中boxA和boxB之間的距離較寬。通常有功能的 此類啟動子中的兩個box就不能緊緊連在一起。但上游啟動子正是這樣。內(nèi)部啟動子中的起始的各個階段，需要涉及 3個起始因子，TF m A已被克 隆，是一種合9個鋅指的蛋白(Zinc finger protein )。TF m B含有TB可口 兩個其它的蛋白。TFmC是一種大分子蛋白復合物，至少有 5個亞基，分為兩個 功能域r A (300KRNA pol m啟動子的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能因子結(jié)構(gòu)TF m A38Kda,有9個鋅指結(jié)合于1型內(nèi)部啟動子(5sRNA基因)的C框，使mC結(jié)合在C框下游，輔助m B定位結(jié)

27、合TF m B含TBP和另外二種蛋白定位因子,使Pol結(jié)合在起始位點上TF m C含t A和只有5個亞基cB結(jié)合n型內(nèi)部啟動子 (tRNA基因)的B框，起增強子的作用。TA結(jié)合A框，起啟動子的作用；輔助W B定位結(jié)合TBP是m B, n D, SL1的亞基和特異DNA序歹U及RNA Pol結(jié)合，使 Pol結(jié)合在正確的位占土八、-1-Tn D含TBP亞基結(jié)合TATA框，確定選擇 Pol mPBP次近端結(jié)合蛋白可能和口 D一道輔助mB定位結(jié)合的另一途徑和pB,分別和2型內(nèi)部啟動子(tRNA基因啟動子)的A框和B框結(jié)合。B框相 當于增強子的作用，A框相當于啟動子的作用。在I型內(nèi)部啟動子中(5sRNA

28、S 因啟動子)TFIH A結(jié)合在C框上，使TFIH C結(jié)合在C框下游。在II型內(nèi)部啟動子 中TF m C的結(jié)合使TFm B依次結(jié)合在起始位點的近上游。TF m B結(jié)合在起 始位點上并和TF m C相連。這些因子作用的突出特點是當將 TFmA和m C從啟動子上除去(在體外 用高濃度的鹽)不影響起始反應。只要 TFm B仍結(jié)合在起始點的附近就能使 RNA poi正確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始點。因此只有 TF m b才是poi m所必需的起始因 子。TF m A和TF m C僅是一種裝配因子(assembly factor ),它們的作用 是輔助TF田B結(jié)合到正確的位置上。這樣就解釋了下游啟動子怎樣使聚合酶結(jié) 合到上游位點。TF m B的功能是作為一個“定位因子” (positioning factor )負責RNApol 結(jié)合正確位置上。就像pol I中的SL1那樣。功能類似于原核的 因子。它本身 缺乏和DNA勺結(jié)合能力，但可以和結(jié)合在 DNA±的其它蛋白結(jié)合。前面已說過 TF m B含有TBP；而SL1也含有TBP；它可能作為 TFmB的一個亞基，直接 和RNAf目互作用。內(nèi)啟動子雖然賦