植物總DNA的CTAB改進(jìn)提取

1、植物總DNA的CTAB改進(jìn)提取一、實驗?zāi)康?掌握從植物或動物的組織（細(xì)胞）中抽提DNA的方法。二、實驗原理十二烷基肌酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基磺酸鈉等去污劑可破壞細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)抽提出來。并且在巰基乙醇、EDTA等的幫助下，可是蛋白質(zhì)變性，抑制DNAse的活性。而且?guī)€基乙醇還可抑制氧化劑對DNA的作用。加入有機溶劑后，其可抽提蛋白質(zhì)，使核蛋白與DNA分離，提純DNA。RNAse可選擇性降解RNA，使DNA純化。醇類可繼續(xù)洗滌DNA，抽提蛋白，最后可得到較純的DNA溶液。三、實驗試劑及材料1、實驗材料李樹幼葉2、實驗試劑a、 DNA提取緩沖液溶液 I（山梨醇提取緩

2、沖液）：350 mmol/L 山梨醇，100 mmol/L Tris-Hcl，5 mmol/LEDTA；溶液 II （2%的CTAB提取緩沖液）：200 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L EDTA,2 mol/L的NaCl ,2%（m/V）的CTAB.將溶液I和溶液II(在使用前) 按照1:1的比例混合均勻,在混合的時候加入6.25g/L的亞硫酸鈉，待亞硫酸鈉完全溶解以后即得到DNA提取緩沖液；b、 1 % 巰基乙醇c、 10 mg/ml RNAse溶液d、 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1，v/v/v）e、 70 % 乙醇f、 異丙醇3、實驗器材臺式離心機，研缽和杵，離心

3、管，微量移液器，槍頭，恒溫水浴鍋四、實驗步驟1.將0.1 g 組織材料于液氮中迅速研磨成粉末，放入離心管中，加入600 uL的抽提緩沖液，再加巰基乙醇10 ul，充分混勻，65 水浴30-60 min，其間上下輕緩混合2-3次（盡量縮短葉片在室溫下的放置時間）。2.取出，降至室溫后加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1，v/v/v），上下輕緩混合10 min，10000 r/min離心10 min。3.取上清，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1，v/v/v），放置2 min，12000 r/min離心5 min。4.取上清，加入10 ul RNAse,37 放置20-30 mi

4、n(可省去)。5.加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，于- 20放置10 min，12000 r/min離心5 min。6.棄上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀。7.12000 r/min離心5min，棄上清，將沉淀于超凈臺上吹干。8.加入20-50 ulTE緩沖液或雙蒸水。9.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。五、實驗結(jié)果及分析1、電泳檢測結(jié)果（見下圖）2、結(jié)果分析如上圖所示，方框內(nèi)為我們小組的李樹幼葉的總DNA電泳檢測結(jié)果。因為RNAse已變性的原因，電泳條帶前端有許多被破壞的RNA片段。后端（下方）可隱約見一條帶，此條帶應(yīng)為提取的李樹總DNA。但是，兩個樣中的條帶都不清晰，這是由于DNA量太少的緣故。其原因可能是以下幾種情況之一或者不是。a、研磨不充分，溶解出的DNA太少。b、最后無菌水加入太多，樣品稀釋過度。c、點樣量過少，