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文檔簡介
1、植物總DNA的CTAB改進(jìn)提取一、實驗?zāi)康?掌握從植物或動物的組織(細(xì)胞)中抽提DNA的方法。二、實驗原理十二烷基肌酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基磺酸鈉等去污劑可破壞細(xì)胞膜、核膜等膜結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)抽提出來。并且在巰基乙醇、EDTA等的幫助下,可是蛋白質(zhì)變性,抑制DNAse的活性。而且?guī)€基乙醇還可抑制氧化劑對DNA的作用。加入有機溶劑后,其可抽提蛋白質(zhì),使核蛋白與DNA分離,提純DNA。RNAse可選擇性降解RNA,使DNA純化。醇類可繼續(xù)洗滌DNA,抽提蛋白,最后可得到較純的DNA溶液。三、實驗試劑及材料1、實驗材料李樹幼葉2、實驗試劑a、 DNA提取緩沖液溶液 I(山梨醇提取緩
2、沖液):350 mmol/L 山梨醇,100 mmol/L Tris-Hcl,5 mmol/LEDTA;溶液 II (2%的CTAB提取緩沖液):200 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L EDTA,2 mol/L的NaCl ,2%(m/V)的CTAB.將溶液I和溶液II(在使用前) 按照1:1的比例混合均勻,在混合的時候加入6.25g/L的亞硫酸鈉,待亞硫酸鈉完全溶解以后即得到DNA提取緩沖液;b、 1 % 巰基乙醇c、 10 mg/ml RNAse溶液d、 酚:氯仿:異戊醇(25:24:1,v/v/v)e、 70 % 乙醇f、 異丙醇3、實驗器材臺式離心機,研缽和杵,離心
3、管,微量移液器,槍頭,恒溫水浴鍋四、實驗步驟1.將0.1 g 組織材料于液氮中迅速研磨成粉末,放入離心管中,加入600 uL的抽提緩沖液,再加巰基乙醇10 ul,充分混勻,65 水浴30-60 min,其間上下輕緩混合2-3次(盡量縮短葉片在室溫下的放置時間)。2.取出,降至室溫后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1,v/v/v),上下輕緩混合10 min,10000 r/min離心10 min。3.取上清,加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1,v/v/v),放置2 min,12000 r/min離心5 min。4.取上清,加入10 ul RNAse,37 放置20-30 mi
4、n(可省去)。5.加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇,于- 20放置10 min,12000 r/min離心5 min。6.棄上清,加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀。7.12000 r/min離心5min,棄上清,將沉淀于超凈臺上吹干。8.加入20-50 ulTE緩沖液或雙蒸水。9.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。五、實驗結(jié)果及分析1、電泳檢測結(jié)果(見下圖)2、結(jié)果分析如上圖所示,方框內(nèi)為我們小組的李樹幼葉的總DNA電泳檢測結(jié)果。因為RNAse已變性的原因,電泳條帶前端有許多被破壞的RNA片段。后端(下方)可隱約見一條帶,此條帶應(yīng)為提取的李樹總DNA。但是,兩個樣中的條帶都不清晰,這是由于DNA量太少的緣故。其原因可能是以下幾種情況之一或者不是。a、研磨不充分,溶解出的DNA太少。b、最后無菌水加入太多,樣品稀釋過度。c、點樣量過少,
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