單克隆抗體多克隆抗體制備修改

1、單克隆抗體多克隆抗體制備班級：03生技6 學號： 姓名：應堯 指導師：鄭蔚紅摘要 單克隆抗體技術是現代生命科學研究的重要工具,在基因和蛋白質的結構和功能研究方面有著不可或缺的作用。本文全面綜述了單克隆抗體研究最新進展。通過構建真核表達載體,采用DNA 免疫、細胞免疫、消減免疫和多位點重復免疫等現代分子免疫學方法,快速制備高親合力的單克隆抗體,改進常規(guī)方法制備單抗費時費力且親合力低的弱點,對后基因時代蛋白質組學等基礎研究領域的研究具有巨大的推動作用;同時在生物芯片、臨床醫(yī)學和疾病的診斷與治療以及空間生命科學等應用領域有著廣闊的應用前景。關鍵詞多克隆抗體, 單克隆抗體單克隆抗體指來自一個B淋巴細胞

2、的單克隆雜交瘤細胞株所分泌的、針對同一抗原決定簇的抗體。1975年，英國科學家米爾斯坦和法國科學家柯勒開創(chuàng)了將產生抗體的單個細胞（如B淋巴細胞）和瘤細胞（如骨髓瘤細胞）雜交的技術，形成雜交瘤細胞，成功地獲得了化學性質單一、特異性強的單克隆抗體，并因此獲得1984年的諾貝爾生理學及醫(yī)學獎。1 半抗原載體復合物有多種結合位點,免疫系統(tǒng)將會產生具有不同特異性的多種抗體(稱為多克隆抗體).多克隆抗體包含不同種類的抗體,所以在免疫檢測使用之前抗體必須標準化。2單克隆抗體的化學本質是蛋白質，合成場所是核糖體，它是由基因控制合成的，合成過程包括轉錄和翻譯兩個重要步驟。B淋巴細胞中產生抗體的基因轉移到了雜交瘤

3、細胞的DNA中，抗體基因在雜交瘤細胞中指揮抗體合成。雜交瘤細胞以有絲分裂的方式大量增殖，所以在雜交瘤細胞的培養(yǎng)過程中，需要定期地用胰蛋白酶處理，然后分裝到更多的培養(yǎng)基中。單克隆抗體具有免疫作用，它與血清抗體相比，優(yōu)越之處在于特異性強、靈敏度高、產量高。 1 單克隆抗體制備1.1單克隆抗體技術的基本原理小鼠骨髓瘤細胞能在體內外無限增殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白,而免疫小鼠脾細胞具有產生抗體的能力,但不能無限增殖。采用融合劑(PEG等) 將這兩種細胞融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有親代細胞的主要特征。既能在人工培養(yǎng)下無限增殖,又能產生特異性抗體。可通過有限稀釋法選育由單個細胞增殖而成的克隆。

4、31.2 單克隆抗體技術的基本的過程包括給小鼠注射一種抗原，它可以被免疫系統(tǒng)識別，因此誘導小鼠的B淋巴細胞產生相應抗體。然后，在培養(yǎng)基中融合小鼠的B 淋巴細胞和小鼠骨髓瘤細胞，產生雜交瘤細胞，經過篩選分離出單個雜交瘤細胞，再使單個雜交瘤細胞擴增，最后分離、純化抗體。但這種方法產生的是純粹的小鼠單克隆抗體，它使患者產生免疫排斥反應。為了克服鼠源性抗體的免疫排斥反應，科學家研究各種各樣的技術使小鼠的抗體人源化。一種方法是用人的組分取代小鼠單克隆抗體抗原結合區(qū)以外的部分。另外一種方案稱為抗體的人源化，即利用遺傳工程的方法，用人源蛋白盡可能多地、有選擇地取代小鼠抗體，包括大部分抗原結合區(qū)。經過長達25

5、 年的努力后，研究者最終把人類B 細胞與骨髓瘤細胞融合，形成的雜交瘤細胞可以產生完全人源化的抗體。它使單克隆抗體更接近商品化。也有一些公司轉向研究轉基因動物和植物，即通過物理、化學或生物學方法，將編碼人源性蛋白質的基因轉入實驗動物（如鼠、羊、牛等）的受精卵中，再將受精卵植入動物子宮，最后培育出可以表達目的蛋白或多肽的轉基因動物。轉基因哺乳動物在它們的乳汁中分泌單克隆抗體，如表達人胰島素的轉基因羊或牛，這些羊或牛的奶中就含有人的胰島素，這樣，一只羊或一頭牛就是一個生物發(fā)生器，通過喂養(yǎng)飼料（草）就可以生產胰島素，大大降低了生產成本，具有巨大的商業(yè)價值。但這類產品還沒有得到FDA 認證，此外從乳汁的

6、蛋白中分離單克隆抗體需要經過煩瑣的步驟，并且遺傳學方法改造以及喂養(yǎng)這些動物還需要花費很多年。傳統(tǒng)制備單克隆抗體的方法需要融合細胞雜交瘤細胞1.將抗原注射到小鼠體內，產生針對該抗原的抗體。2.a. 從脾臟中分離各種B 淋巴細胞（可以產生抗體的細胞）。2.b. 從骨髓瘤（一種骨髓癌）中獲得可以無限繁殖的骨髓瘤細胞。3.融合的細胞形成雜交瘤細胞，未融合的細胞則死亡。4.分離雜交瘤細胞，并在培養(yǎng)基中進行分裂增殖。5.挑選可以與初始抗原結合的雜交瘤細胞。6.在實驗室或小鼠腹腔中使雜交瘤細胞增殖。7.從培養(yǎng)基或小鼠腹水中純化抗體。噬菌體感染細菌的病毒，可以替代雜交瘤細胞1.將編碼與抗原結合的各種抗體片段的

7、基因插入細菌細胞，再用噬菌體感染細胞。2.被噬菌體感染的細菌產生新的噬菌體，每個噬菌體的一端攜帶一個不同的抗體片段。3.從噬菌體混合物中，篩選出攜帶抗體片段的噬菌體，這些抗體片段僅與目的抗原特異結合。重復上述過程2-3次。4.將篩選出的噬菌體基因放回細菌中，制備大量、特異的抗體片段。5.將抗體片段拼接在抗體骨架上，制備完整抗體。1.3 單克隆抗體優(yōu)點單克隆抗體有很多優(yōu)點,如:高度的單一性和均一性;高效價;免疫抗原不需提純,但可獲得純抗體;可獲得不同特異性(組、型、株) 的單克隆抗體 ;產量高,可連續(xù)生產等。這些優(yōu)點中,尤其是均一的高特異性,使單克隆抗體有著極廣泛的實用價值,在世界上已形成頗為熱

8、門的新興產業(yè)。2多克隆抗體制備用提純病毒液免疫大耳白兔, 第一次耳靜脈注射013mg , 以后為肌肉內多點注射, 每兩周注射1次, 每次015mg , 用等體積弗氏不完全佐劑(Sigma) 乳化, 共免疫3 次, 末次注射2 周后從耳靜脈取血測定抗血清效價。傳統(tǒng)制備大量抗體的方法主要有2 種,一種方法是直接免疫大型動物(如兔、山羊等) 后獲取抗血清,該方法制備的為多克隆抗體,具有免疫用抗原需要量高、免疫周期長、購買和飼養(yǎng)大動物成本較高等局限性;第2 種方法是采用雜交瘤技術8篩選獲得雜交瘤細胞株后,用癌細胞誘發(fā)腹水的方法來獲得大量的單克隆抗體. 目前應用最為廣泛的主要是鼠源性的單克隆抗體,該方法

9、制備細胞株時間比較長,需經常凍存和復蘇細胞株,對實驗條件、無菌操作等要求較高,并有細胞株分泌抗體能力丟失的風險. 特異性的抗體制備是很多實驗室經常要做的一項工作,采用有限的抗原免疫成本低、容易飼養(yǎng)的小鼠,經濟高效地獲得特異性的抗體是科技人員的理想選擇. 我們以人絨毛膜促性腺激素和人免疫球蛋白作為抗原,通過小劑量、多次免疫Balb/ c鼠,于免疫鼠腹腔內注射石蠟油和NS - 1 骨髓瘤細胞刺激產生腹水的方法,獲得了大量高效價的抗hCG和抗人免疫球蛋白的鼠源性多克隆腹水抗體,為研究和應用提供了基礎.3 單克隆抗體的應用價值分析3.1 細菌學方面的作用利用單克隆抗體鑒定和分離微生物成分,有助于研制新

10、疫苗,改進現有疫苗。例如:研制出副作用少的破傷風多肽菌苗。3. 2 病毒學方面的作用人類對于由流感病毒抗原性突變產生的病毒突變株缺乏免疫力,往往在其抗原性突變時引起世界性流行。風流感病毒血凝素抗原的單克隆抗體,已檢出以前不能檢出的毒株之間的差異。這樣就能及時監(jiān)測病毒的抗原變化,遏制流感的世界性流行 。43. 3 傳染病學方面的作用3.3.1 傳染病的診斷將單克隆抗體制成特異性的診斷試劑盒,能夠早期、快速、準確地用于乙型肝炎、流行性出血熱,風疹病毒等傳染病的診斷。如我國制備的乙型肝炎血凝試驗診斷試劑盒達到世界衛(wèi)生組織認可的標準。3.3.2 傳染病的治療用細胞工程產生的單克隆抗體,著重調節(jié)機體的免

11、疫功能而較少副作用,因而在多種疾病的治療上,具有傳統(tǒng)藥物所不可替代的作用。如單克隆抗體可取代高效價的人免疫球蛋白制劑,作為抗生素的輔助治療,降低某些傳染病的發(fā)病率和死亡率。在我國用單克隆抗體技術治療乙型腦炎獲得突破,已用于乙腦的臨床治療。這在國內外尚屬首次。3.4腫瘤學方面的作用3.4.1 有助于研究腫瘤的發(fā)生機制如蛋白激酶C(PKC) 于1971 年被發(fā)現以來,在生命活動中日益顯示出它的重要性,不僅在生命信號系統(tǒng)中起重要作用,而且是腫瘤促進劑佛波脂的細胞內受體,與腫瘤發(fā)生有著密切的關系。PKC 單抗的制備,可有助于探討PKC 在細胞增殖和轉化中的作用。53.4.2 腫瘤診斷用同位素標記單克隆

12、抗體,可追蹤尋找體內的特異性抗原。如檢查腫瘤細胞的轉移或擴散;也能制造出具有特殊選擇性的單克隆抗體 ,在癌癥早期無癥狀時獲得診斷,而這時,癌癥大多是可以治愈的。3.4.3 腫瘤的治療單克隆抗體還用于治療腫瘤,一種是直接治療法。第二種是將單抗作為載體,與抗癌藥物如:放射性核素、毒素、化療藥物等交聯,制成“生物導彈”,直接達到腫瘤內,殺死癌細胞。這樣還可減少對正常細胞的殺傷。這種腫瘤生物療法有可能成為繼手術、放療、化療之后的第四種腫瘤治療方法。6例如:用人的抗體GM2 單抗局部注射治療惡性黑色素瘤已取得較好療效。最近有報道:美國科學家以單抗為基礎制成的“RITUXAN”,用于治療非何杰金氏淋巴癌,

13、這種治癌新藥與化療不同,不會傷害癌變病灶周圍其他種類的細胞。3.5 移植免疫學方面的應用應用抗T 細胞,抗IL - 2R 的單克隆抗體可防治器官移植排斥反應,目前已用于腎移植患者,可延長移植物的存活時間。此外,在生殖免疫學方面,單抗還是尋找精子抗原研究精子表面大分子的結構與功能的最重要的分子探針。迄今為止,人們用單抗已找到不少人和動物的精子抗原。因為精子必須經過獲能(CA) 和頂體反應(AR) 才具有受精能力,故利用單抗研究CA 和AR 前后精子細胞內和細胞表面大分子的變化,可探索新的避孕方法和男性不育診斷及治療的新途徑。3.6單克隆抗體幫助學習科學家已為將來開發(fā)一種能增強學習效果的藥物打下基

14、礎。有認知困難,反應遲鈍的人將可以接受一種以單抗B6B21 為基礎出來的藥物的治療。這種單抗能與大腦的某些受體結合,將其注射到家兔體內后,這些家兔在完成簡單任務的時候,速度提高了一倍。3.7生物工藝學方面的應用制成能與特殊細胞反應的單抗,應用于細胞分離。再如:使用能表達人類淋巴細胞表面抗原的昆蟲細胞制備的單抗,不激發(fā)針對人類細胞的免疫反應,故可使用源于人的建株細胞進行單抗的篩選,可大大減化篩選過程。3.8基因工程方面的應用鼠源單抗用于治療有一定的困難,一個替代方法是用DNA 重組技術創(chuàng)造人鼠嵌合體,這樣構造的抗體既保持了鼠單抗的特異性和親和力,又大大減少了在人體內的免疫原性。如抗胃癌、抗小細胞

15、肺癌的嵌合抗體已制備出來,抗乙腦病毒單抗輕鏈可變區(qū)基因的被分離和鑒別。7此外,單抗還用于基因目的產物的提純后處理工藝。3.9基礎研究方面的應用對抗原的深入研究。分析細胞表面抗原及形態(tài)。血中T 淋巴細胞亞類的鑒定。分析病原菌抗原?？贵w結構和功能的進一步研究。鑒定微生物。由此可見,單抗技術已深入到醫(yī)學和生物學的各個領域,成為一種必不可少的工具,具有極為重要的理論研究價值和實用價值。目前,單抗技術已基本完善,大量的單抗已應用各個領域。當前的研究重點是制備、應用新的單抗,擴大已有單抗的應用范圍,特別是臨床治療的單抗和導向藥物,尚有較大潛力。4 單克隆抗體研究新進展4.1 DNA 免疫DNA 免疫,也叫

16、基因免疫。1990 年Wolf 等發(fā)現小鼠肌肉直接注射純化的DNA 或RNA 重組表達載體,可使載體上的基因在局部肌細胞內表達持續(xù)數月甚至終身,而且沒有檢出外源核酸與宿主染色體整合。這一發(fā)現打開了通往一種新的免疫途徑的大門。由于不加任何佐劑或載體,故又稱為裸DNA 免疫。以遺傳物質方式直接進入機體的DNA 免疫與傳統(tǒng)的蛋白免疫及用基因工程技術制備的純化蛋白免疫相比有很多優(yōu)點:該技術是將編碼目的抗原或病原體的質粒DNA 接種于宿主體內或細胞內。這些目的抗原或病原體在胞內合成,產生可直接與類或類MHC 分子結合的抗原肽以呈遞抗原,激起機體廣泛的免疫反應,使機體對質粒所編碼的抗原產生強烈而持久的細胞

17、和體液免疫應答。用含開放讀碼框和合適真核轉錄翻譯控制信號的質粒DNA 免疫,可誘發(fā)機體合成構象及翻譯后加工形式與天然結構相同的蛋白。內源蛋白的合成類似病毒的感染,可以以類途徑呈遞外源蛋白,而專職APC 攝入可溶蛋白,可以以類途徑呈遞蛋白。因此免疫反應的兩條途徑都被激活。此外,DNA 免疫不會引起由活病原體感染引起的細胞死亡及炎癥等組織變化。各種因素影響著DNA 免疫后基因的表達,包括使用的質粒、給藥方式及器具。目前使用的質粒通常含來自人巨細胞病毒、SV40 病毒及- 肌動蛋白的極早期啟動子,它們可以在許多類細胞中引發(fā)高水平的基因表達。最近對DNA 表達載體的改進包括增加內含子和有效的轉運終止/

18、 加工單元、修飾載體增強抗原表達、改良物理轉運方法9,10和佐劑的使用11 。 Briones M1213 等用可生物降解和相容的聚合物制備吸附質粒的陽離子微粒,通過改變微粒上DNA 的載荷,同時轉運幾種質粒增強免疫反應。增強DNA 反應性的方法包括增加DNA 的穩(wěn)定性,增加DNA 在被注射組織中的分散性,以及共表達共刺激因子(如B27. 1 、B27. 2 和CD40) 1415 ,增加抗原的呈遞或共刺激作用,或者通過共表達細胞因子、免疫刺激因子(如IL22 、IL27 、IL210 、IL218 或GM2CSF) 增強免疫反應16 。IL212 在先天性和獲得性免疫中起主要作用,它可誘導靜

19、息和激活的T 細胞以及N K 細胞產生大量的IFN2,因此常作為佐劑增強DNA 的反應性;但Chen17等的研究卻證實IL212 表達質粒抑制一種日本腦炎病毒DNA 疫苗的保護性免疫反應。另一個途徑是使用雙順反子載體,裝載抗原和免疫反應增強子的基因。DNA 免疫也可以用來產生針對非病毒病原體的抗體。通過肌肉注射質粒DNA ,已經成功地產生了針對一種原生動物寄生蟲(Schistosoma japon2icum) ,原生生物(Leishmania major 和Plasmodiumjoelii ) , 細菌( Mycobacterium tuberculosis ) 和Salmonella typ

20、hi ,Mycoplasma pulmonis 的抗體反應。Tang 等的研究表明用含外源基因的真核表達載體免疫動物,能有效刺激機體產生體液免疫應答,該技術已被成功地應用于單抗的制備,Barry 等用此方法成功制備了高親合力的抗人生長激素單克隆抗體,能結合天然的生長激素。目前, 運用DNA 免疫的方法, 已成功制備了生長激素、flt318 、凝血因子IX、INF219和血型抗原20等,病原微生物如:prion、Helicobacter pylori 和HIV ,膜分子G- 蛋白偶連受體等的單克隆抗體。最近Li20等采用肌肉組織特異性的啟動子來進一步提高DNA 免疫的效果,其基本思想是構建含肌肉

21、組織特異啟動子DNA 免疫載體,使抗體的親合力增加了10 倍。因此,在目的基因前加上肌肉組織特異的啟動子或改構表達載體上的調控序列,可提高DNA 免疫抗體的親合力。DNA 免疫制備單克隆抗體除了上述優(yōu)點外,由于基因操作簡單,對免疫原性較弱的蛋白,通過與免疫原性較強的蛋白構建融合基因載體進行免疫,如HIV 的外殼基因Env 和補體成分C3d DNA疫苗表達融合蛋白可增強HIV 外殼蛋白抗體的親合力成熟21 ;同時也可以構建含有多種蛋白的融合基因載體進行免疫,產生針對不同蛋白的單克隆抗體。因此,DNA 免疫的研究日益引起學者們的關注,且得到越來越廣泛的應用22 。 1 雍占高.何謂單克隆抗體J.

22、廣西師范大學出版社.學生理科月刊,2003,4:82 余若禎,何苗,施漢昌,錢易. 小分子環(huán)境污染物的免疫檢測技術及其研究進展D. 環(huán)境工程.2005,03, 3 錢玉昆. 臨床免疫學. 第1 版. 北京:北京醫(yī)科大學,中國協和醫(yī)科大學聯合出版社,1994. 9 :1454 劉仲敏. 單克隆抗體技術簡介. 生物通報,1985. 6 :185 李華等. 蛋白激酶C 單克隆抗體的制備. 北京師范大學學報,1993. 29 :1376 張存浩等. 免疫學. 第1 版. 北京:科學技術出版社,1994 ,7207 黃發(fā)燦等. 抗乙腦病毒單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因的分離和鑒別。病毒學報,1993

23、 ,1 ; (1) :738 KOHLER G,MILSTEIN C. Continuous cultures of fusedcells secreting antibody of predefined specificityJ . Nature ,1975 ,256(5517) :4952497.9 Mann MJ , Gibbons GH , Hutchinson H , et al . Pressure2medi2ated oligonucleotide transfection of rat and human cardiovascu2lar tissuesJ . Proc Natl

24、 Acad Sci USA ,1999 , 96 (11) :.10 Rizzuto G, Cappelletti M , Maione D , et al . Efficient and reg2ulated erythropoietin production by naked DNA injection andmuscle electroporationJ . Proc Natl Acad Sci USA ,1999 , 96(11) :.11 Ulmer JB , DeWitt CM , Chastain M , et al . Enhancement ofDNA vaccine pot

25、ency using conventional aluminum adjuvantsJ . Vaccine 1999 , 18 (1 - 2) :1828.12 Singh M , Briones M , Ott G, et al . Cationic microparticles : apotent delivery system for DNA vaccinesJ . Proc Natl AcadSci USA ,2000 ,97 (2) :8112816.13 Briones M , Singh M , Ugozzoli M , et al . The preparation ,char

26、acterization , and evaluation of cationic microparticles forDNA vaccine delivery J .PharmaceuticalResearch ,2001 , 18(5) : 7092722.14 Sin J I , Kim JJ , Zhang DH , et al . Modulation of cellular re2sponses by plasmid CD40L : CD40L plasmid vectors enhanceantigen2specific helper T cell type 1 CD4 T ce

27、ll2mediated pro2tective immunity against herpes simplex virus type 2 in vivoJ . Human Gene Therapy ,2001 ,12 :.15 Majlessi L , Bordenave G. Role of CD40 in a T cell2mediatednegative regulation of Ig productionJ . J Immunol ,2001 ,166(2) : 84127.16 Chen HW, Pan CH , Huan HW, et al . Suppression of im

28、2mune response and protective immunity to a Japanese en2cephalitis virus DNA vaccine by coadministration of an IL2122expressing plasmidJ . J Immu , 2001 ,166 (12) :.17 Chan K, Lee DJ , Schubert A , et al . The roles of MHC classII , CD40 , and B7 costimulation in CTL induction by plasmidDNAJ . J Immunol ,2001 ,166 (5) : 306126.18 Kilpatrick KE , Cutler T , White E , et