扶正治標(biāo)法對(duì)青少年花粉癥患者相關(guān)基因表達(dá)的影響

1、扶正治標(biāo)法對(duì)青少年花粉癥患者相關(guān)基因表達(dá)的影響【摘要】 目的： 研究中藥治療花粉癥的作用機(jī)理。方法： 選擇50例花粉癥患者，口服敏康片，治療6個(gè)月后觀察療效及FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A基因表達(dá)情況，并以20例變應(yīng)性皮炎和19例正常人為對(duì)照，用Northern blot檢測(cè)FcRI,IL-4R,IL-5R的變化。用RT-PCR 法檢測(cè)HLA-A，計(jì)算相對(duì)光密度值。結(jié)果： 花粉癥組患者癥狀有明顯改善（P<0.05），治療前后血清總IgE比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），花粉癥組4個(gè)基因的表達(dá)治療前與正常人比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&lt

2、;0.01)，治療后與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。變應(yīng)性皮炎組治療前FcRI,IL-4R與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療前后FcRI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鼻炎組、皮炎組HLA-A相對(duì)光密度值均較正常組高，兩組治療前后也有不同程度的改善(P<0.05)。結(jié)論： 中藥可以調(diào)整花粉癥患者相關(guān)基因表達(dá)，改善患者過(guò)敏體質(zhì)，緩解臨床癥狀。 【關(guān)鍵詞】 花粉癥； 敏康片； 基因表達(dá)； Northern blot； 中醫(yī)藥療法Abstract Objective: To evaluate the eff

3、icacy of Minkang tablet on gene express in the patients with hay fever. Methods： The trial involved 50 patients with hay fever,20 patients with atopic dermatitis, Minkang tablet(three capsule, twice a day, 6 months) was given to patients with hay fever(50)，also 19 as normal as control. Results： The

4、symptom and IgE after medication had difference highly statistically significant before medication. The FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A related with atopy before and after medication, FcRI,IL-4R,IL-5R,HLA-A in the patients with hay fever and in normal were different highly statistically significant(P<

5、0.01) before medication; and genes express improved significantly(P<0.01) after medication. FcRI,IL-4R of the patients with atopic dermatitis and in normal were statistically significant(P<0.05) before medication, FcRI improved significantly(P<0.05) after medication. Conclusion：

6、 Minkang tablet was effective in controlling gene express on patients with hay fever.Key words hay fever; herb; gene express; northern blot; TCM花粉癥是一種常見(jiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，臨床以鼻塞、流涕、噴嚏、鼻癢等為主要癥狀,全球平均發(fā)病率在 10%25%左右1。近年來(lái)，我國(guó)的發(fā)病率也有逐漸上升趨勢(shì)。西醫(yī)學(xué)的治療多采用對(duì)癥處理，能夠較好地控制臨床癥狀，但容易復(fù)發(fā)，副反應(yīng)大。中醫(yī)治療從調(diào)整患者過(guò)敏體質(zhì)著手，有標(biāo)本同治的效果，但作用機(jī)理卻不清楚。2002年1月2

7、005年12月，我們就中藥對(duì)花粉癥患者相關(guān)基因表達(dá)的影響做了初步研究，現(xiàn)報(bào)告如下。1 對(duì)象與方法1.1 研究對(duì)象1.1.1 臨床資料 全部患者和正常人均來(lái)自我們2004年3月2004年12月在河南林州進(jìn)行的臨床調(diào)查?；ǚ郯Y組50例，男性33例，女性17例，年齡1218歲，平均（14.5±1.2）歲。變應(yīng)性皮炎組20例，男性13例，女性7例，年齡1217歲，平均（14.2±1.3）歲。正常組19例，男性13例，女性6例，年齡1317歲，平均（15.8±1.1）歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，各組基本情況差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 花粉癥診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)1997年中華醫(yī)學(xué)會(huì)

8、在?？谛抻喌淖儜?yīng)性鼻炎診治標(biāo)準(zhǔn)2。變應(yīng)性皮炎診斷參照Williams標(biāo)準(zhǔn)3?；颊咝柰膺M(jìn)入治療觀察，在此期間堅(jiān)持服用待試藥物，每周記錄癥狀，停止其他一切治療手段。排除以下病例：同時(shí)使用相應(yīng)激素或其他藥物；合并有影響判定療效的鼻病如鼻息肉、鼻竇炎等；合并有心、腦血管，肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病。1.2 方法1.2.1 藥物及服法 花粉癥組和變應(yīng)性皮炎組患者口服敏康片（靈芝、蟲草菌絲體等），每日2次，每次3片。正常組口服金施爾康（中美施貴寶有限公司生產(chǎn)）每日1次，每次2片。各組均治療6個(gè)月。1.2.2 主要儀器和試劑 Trizol(Invitrogen公司)，Invitrogen膠回收試劑盒

9、，Beckman DU7500紫外分光光度計(jì)（美國(guó) Beckman 公司），電泳儀（Bio-Rad公司）。1.2.3 檢測(cè)項(xiàng)目 兩組均采用北京海奧公司IVT過(guò)敏原試劑檢測(cè)總IgE。用Northernblot法檢測(cè)FcRI,IL-4R和IL-5R基因表達(dá)水平。地高辛標(biāo)記探針(FcRI,IL-4R,IL-5R引物均由Sangon公司合成)。FcRI引物序列參照文獻(xiàn)4；IL-4R引物序列參照文獻(xiàn)5；IL-5R引物序列參照文獻(xiàn)6。用RT-PCR 法檢測(cè)HLA-A，HLA-A 引物由Sangon 公司合成,引物序列參照文獻(xiàn)7：5-GACGACACGCAGTTCGTGC-3，5-CATGTCCGCCGCG

10、GTCCAA-3，目的片段331 bp，內(nèi)參-actin 引物5-CACCATGTACCCTGGCATTG-3，5-TAACGCAACTAAGTCATAGT-3。采用英國(guó)Syngene公司凝膠分析系統(tǒng)(GDS 8000, Gene Tools from Syngene software)檢測(cè)計(jì)算各組光密度值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,兩樣本均數(shù)差異采用t檢驗(yàn)（方差不齊進(jìn)行t檢驗(yàn)）,取0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2 結(jié)果2.1 臨床療效 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)在?？谛抻喌摹白儜?yīng)性鼻炎診治標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)”2判斷療效?；ǚ郯Y組顯效22例，有效19例，無(wú)效9例，總有效率82，治療前癥狀積分為9.8

11、6±1.44，治療后為4.04±1.38，治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.2 免疫學(xué)指標(biāo)比較 經(jīng)過(guò)敏原試劑檢測(cè)總IgE，花粉癥組與變應(yīng)性皮炎組患者治療前后血清總IgE的比較見(jiàn)表1。 表1 兩組治療前后血清總IgE比較（略）Tab 1 Comparison of serum total IgE betweendifferent groups#: P<0.05，#: P<0.01，與治療前比較 2.3 基因表達(dá)水平比較 花粉癥組和變應(yīng)性皮炎組IL-4R治療前與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（花粉癥組t=34.820 3，P&a

12、mp;lt;0.01；皮炎組t=18.466 8，P<0.01）?；ǚ郯Y組IL-4R治療前后比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t=44.565 1, t(0.050 0)=2.0117, P<0.05?；ǚ郯Y組IL-5R治療前與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.624 4，P<0.01），治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義t=41.184 6, t(0.050 0)=2.011 7，P<0.05。 FcRI兩組治療前與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義花粉癥組t=52.831 9，P<0.01；皮炎組t=22.232 2, t(0.050 0

13、)=2.108 6, P<0.05，治療前后組內(nèi)比較,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義花粉癥組t=55.105 7,P<0.01；皮炎組t=17.999 1, t(0.050 0)=2.109 8, P<0.05。詳見(jiàn)表2。 用RT-PCR 法檢測(cè)HLA-A，通過(guò)計(jì)算各組相對(duì)光密度值（目的條帶光密度內(nèi)參-actin 條帶光密度），結(jié)果花粉癥組、變應(yīng)性皮炎組HLA-A 均較正常組表達(dá)高，而兩組治療前后均有不同程度的改善（見(jiàn)表3）。直接從各組電泳結(jié)果也可看出，相關(guān)基因表達(dá)情況與以上處理結(jié)果一致（圖1）。表2 各組治療前后光密度值比較（略）Tab 2 Comparison

14、 of D value between three Groups#：P<0.05，#:P<0.01，與治療前比較; *:P<0.05，* :P<0.01,與正常組比較（4例抽提DNA失?。?圖1 各組電泳圖（略）Fig 1 Electrophoregram in different Groups表3 各組HLA相對(duì)光密度（略）Tab 3 Comparatively D value of HLA-A betweenthree Groups#: P<0.05，#:P<0.01，與治療前比較； *:P<

15、0.05，*: P<0.01，與正常組比較（4例抽提DNA失?。?3 討論 花粉癥是發(fā)生在鼻粘膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬I型變態(tài)反應(yīng)。變應(yīng)原初次被吸入后, 刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE,T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。特異性IgE結(jié)合在鼻粘膜上皮細(xì)胞和表面的肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞的細(xì)胞膜上，此時(shí)鼻粘膜便處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次吸入變應(yīng)原時(shí)，變應(yīng)原即與肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞表面的IgE 發(fā)生橋連，同時(shí)激發(fā)T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，繼而發(fā)生一系列生化反應(yīng)，導(dǎo)致以組胺為主的多種介質(zhì)釋放。這些介質(zhì)通過(guò)鼻粘膜血管、腺體、神經(jīng)末梢上的受體等,引起機(jī)體(系統(tǒng))和鼻粘膜上皮細(xì)胞局部明顯的組織反應(yīng)而發(fā)病。 目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，

16、花粉癥是一種多基因疾病。其發(fā)病除與環(huán)境、免疫等因素有關(guān)外，還有明顯的遺傳傾向, 但其遺傳基因尚不清楚。鑒于過(guò)敏者在遺傳學(xué)上有結(jié)構(gòu)和功能上的特征和缺陷，而現(xiàn)代基因技術(shù)又為探討這種特征和缺陷，弄清中醫(yī)藥對(duì)相應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控作用提供了可能，因此，本項(xiàng)研究將從體質(zhì)之本先天（遺傳）因素出發(fā)，研究花粉癥（過(guò)敏體質(zhì)患者）的基因表達(dá)特點(diǎn)以及治本中藥對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響，并以特應(yīng)性皮炎為平行對(duì)照，正常人為參照。由于變態(tài)反應(yīng)炎癥中有很多細(xì)胞因子參與，且相應(yīng)有高水平表達(dá)，所以在相關(guān)細(xì)胞因子及其受體的基因位點(diǎn)尋找特應(yīng)癥的候選基因也是一個(gè)研究的方向。目前研究主要在集中在IL-4,IL-5,IgE等?，F(xiàn)已證明，IL-4為

17、多反應(yīng)性免疫調(diào)控因子，對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的增殖、分化具有重要調(diào)控作用，能誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE；IL-5則促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞增生、分化；位于嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的IgE/FcRI復(fù)合體結(jié)合相應(yīng)變應(yīng)原，介導(dǎo)型速發(fā)型超敏反應(yīng)8。產(chǎn)生IgE 的調(diào)控基因位于HLA 區(qū)域，許多花粉癥的基因研究集中在這一區(qū)域。目前國(guó)外對(duì)上述基因的研究較多，關(guān)于它們與過(guò)敏性疾病相關(guān)性的結(jié)論也較為明確9-11，故而本項(xiàng)研究選擇了這幾個(gè)基因。 花粉癥屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病的病因病機(jī)是風(fēng)寒之邪外襲，肺脾腎內(nèi)虛。其病機(jī)中外邪固然是致病誘因，但根本還在于肺氣虛。敏康片是何裕民教授的經(jīng)驗(yàn)方，由靈芝、蟲草

18、、白芷等組成，具有益肺、固本、通竅之功效。方中靈芝滋補(bǔ)強(qiáng)壯、益氣固本，蟲草補(bǔ)肺益腎，助陽(yáng)填精，強(qiáng)壯滋補(bǔ)，白芷通鼻竅?，F(xiàn)代研究提示靈芝有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力12，蟲草多糖單獨(dú)或協(xié)同PHA 誘導(dǎo)IL-2R 的表達(dá),促進(jìn)可溶性IL- 2R 的生成，對(duì)外周血淋巴細(xì)胞具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用13。服藥后患者主要臨床癥狀積分有所改善，血清總IgE也有所下降，表明體內(nèi)的高致敏狀態(tài)有所緩解。 我們的研究結(jié)果提示，患者的相關(guān)基因表達(dá)水平也有所改變14。IL-4R在兩組患者中治療前均較正常組高，花粉癥組治療后降低?；ǚ郯Y組治療前IL-5R較正常組高，治療后降低。兩組治療前FcRI均較正常組高，治療后均降低。變應(yīng)性皮炎組

19、IL-4R,FcRI治療前均較正常組表達(dá)高，治療后只有FcRI有所降低?；ǚ郯Y組、皮炎組HLA-A 均較正常組表達(dá)高，而治療后有不同程度的改善。從以上結(jié)果可以看出，F(xiàn)cRI,HLA-A,IL-4R和IL-5R主要在花粉癥患者中改變比較多，敏康片的療效也相對(duì)較好。而變應(yīng)性皮炎組上述基因表達(dá)改變不大，療效也不是很明顯。這主要是因?yàn)槲覀冊(cè)诹㈨?xiàng)時(shí)，主要查詢了花粉癥的文獻(xiàn)，在此基礎(chǔ)上選擇上述基因作為觀察項(xiàng)目。而敏康片的配方也主要針對(duì)花粉癥，從中醫(yī)理論上講不適合皮炎病機(jī)，療效亦一般。通過(guò)對(duì)幾個(gè)基因的檢測(cè)，我們可以初步看出，敏康片對(duì)花粉癥等的作用，一方面是調(diào)節(jié)相關(guān)IgE調(diào)控基因，達(dá)到改善機(jī)體高敏狀態(tài)的作用，

20、另一方面可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子相關(guān)基因，緩解機(jī)體的炎癥，減輕癥狀。這是個(gè)多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)過(guò)程。 對(duì)照藥物選用金施爾康主要是從體質(zhì)研究的角度考慮，同時(shí)顧及醫(yī)學(xué)倫理和患者的可接受度。金施爾康作為多種維生素和微量元素的復(fù)合保健品，并沒(méi)有明確的治療變應(yīng)性鼻炎的療效，只具有安慰劑的性質(zhì)。同時(shí)，有研究表明變應(yīng)性鼻炎患者存在微量元素的失衡，肺氣虛、脾氣虛和腎氣虛者，發(fā)鋅含量低于常人，銅/鋅值升高，同時(shí)發(fā)錳含量亦升高15,因此，從某種意義而言，金施爾康也具有治療作用，也帶有治本的性質(zhì)，但不同于治療組藥物改善氣虛體質(zhì)的治本，它改善、調(diào)整的是患者體內(nèi)可能存在的微量元素失衡的狀況?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 王德云.應(yīng)重視對(duì)變應(yīng)性鼻炎

21、的研究J.中華耳鼻咽喉科雜志,2005,40(3):163-165.2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)分會(huì)，中華耳鼻咽喉科雜志編輯委員會(huì).變應(yīng)性鼻炎診治標(biāo)準(zhǔn)及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)J.中華耳鼻咽喉科雜志,1998,33(3):134.3 顧 恒,陳祥生,陳 菎,等.特應(yīng)性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)J.中華皮膚科雜志,2000,33(4):222.4 Wakahara S, Fujii Y, Nakao T,et al. Gene expression profiles for Fc epsilon RI, cytokines and chemokines upon Fc epsilon RI activation in

22、 human cultured mast cells derived from peripheral bloodJ. Cytokine, 2001, 16(4):143-152.5 Saito S, Harada N, Ishii N, et al. Functional expression on human trophoblasts of interleukin 4 and interleukin 7 receptor complexes with a common gamma chainJ. Biochem Biophys Res Commun,1997,231(2):429-434.6

23、 Rizzo CA, Yang R, Greenfeder S, et al. The IL-5 receptor on human bronchus selectively primes for hyperresponsivenessJ.J Allergy Clin Immunol， 2002,109(3):404-409.7 Palmisano GL, Pistillo MP, Capanni P,et al. Investigation of HLA class I downregulation in breast cancer by RT-PCRJ. Hum Immunol. 2001,62(2):133-139.8 龍振周.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997:22.9 Izuhara K, Yanagihara Y, Hamasaki N,et a