植物生物技術(shù) 愈傷組織的誘導(dǎo)繼代及分化

1、植物愈傷組織的誘導(dǎo)、植物愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代及分化繼代及分化專業(yè)：生化分子專業(yè)：生化分子姓名：楊婷姓名：楊婷學(xué)號：學(xué)號：16231200191623120019主要內(nèi)容第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)第二節(jié)第二節(jié) 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的分化與植株再生愈傷組織的分化與植株再生第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)一、愈傷組織的概念一、愈傷組織的概念 指植物受到機(jī)械、動物、微生物等指植物受到機(jī)械、動物、微生物等傷害傷害后，創(chuàng)傷部位的細(xì)胞后，創(chuàng)傷部位的細(xì)胞脫分化脫分化而而不斷增值形成松散排列、無特定結(jié)構(gòu)和功能的不斷增值形成松散排列、無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁分生

2、群薄壁分生群。 愈傷組織培養(yǎng)已被廣泛的用于愈傷組織培養(yǎng)已被廣泛的用于植物突變體篩選、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物突變體篩選、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及以及無無性快速繁殖性快速繁殖等方面的研究。同時，未分化愈傷組織也是等方面的研究。同時，未分化愈傷組織也是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及及原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體分離和和培養(yǎng)培養(yǎng)主要的材料來源和良好的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。主要的材料來源和良好的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。二、愈傷組織的誘導(dǎo)1 1、外植體的選擇、外植體的選擇 選擇外植體要綜合考慮以下幾個因素選擇外植體要綜合考慮以下幾個因素: : 大小要適宜，不宜太小。外植體的組織塊要達(dá)到大小要適宜，不宜太小。外植體的組織塊要達(dá)到2 2萬個細(xì)胞

3、萬個細(xì)胞（5-10mg5-10mg）以上才容易成活；）以上才容易成活；同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差別；同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當(dāng)大的差別；植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織；植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量的愈傷組織；不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。不同物種相同部位的外植體其分化能力可能大不一樣。 總之，外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜?？傊?，外植體的選擇一般以幼嫩的組織或器官為宜。用于培養(yǎng)的外植體包括根、莖、葉、用于培養(yǎng)的外

4、植體包括根、莖、葉、果實、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。果實、子房、花粉、花瓣等各種器官或組織。2 2、外植體材料的消毒、外植體材料的消毒一般采用一般采用次氯酸鈉次氯酸鈉，其能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。，其能分解成為具有殺菌效能的氯氣，然后就散失到空氣中。使用時按使用時按1:101:10稀釋，消毒時間以材料定，消毒后無菌水沖洗稀釋，消毒時間以材料定，消毒后無菌水沖洗4-54-5次。次。0.1%0.1%氯化汞氯化汞是一種令人滿意的消毒劑，只是難以去除，故在消毒后必須用大量清是一種令人滿意的消毒劑，只是難以去除，故在消毒后必須用大量清水沖洗材料。水沖洗材料。在材料放入消毒

5、劑之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄濕，從而使消在材料放入消毒劑之前，先在乙醇中漂洗一下，可以使材料表面弄濕，從而使消毒劑易于滲入并殺死微生物。毒劑易于滲入并殺死微生物。3 3、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基采用的培養(yǎng)基的基本成分相似，但對于不同植物，同一植物不同物種都要對培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基的基本成分相似，但對于不同植物，同一植物不同物種都要對培養(yǎng)成分作相應(yīng)改動，尤其是成分作相應(yīng)改動，尤其是激素的成分和濃度是極為重要的因素激素的成分和濃度是極為重要的因素。一般選擇。一般選擇鹽濃度較鹽濃度較高的培養(yǎng)基高的培養(yǎng)基如如MSMS，B5B5及它們的改良培養(yǎng)基來進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。及它們的改良培養(yǎng)基來進(jìn)行愈傷

6、組織誘導(dǎo)效果較好。培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中還原態(tài)氮還原態(tài)氮（主要為銨態(tài)氮）含量高，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)；（主要為銨態(tài)氮）含量高，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)；高鈣高磷高鈣高磷組合的培養(yǎng)基有利于小麥愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和再生。對大多數(shù)植物組合的培養(yǎng)基有利于小麥愈傷組織的誘導(dǎo)、生長和再生。對大多數(shù)植物組織來講，組織來講，激素激素是愈傷組織培養(yǎng)基中不可缺少的組成成分。是愈傷組織培養(yǎng)基中不可缺少的組成成分。生長素生長素，對于細(xì)胞分裂，對于細(xì)胞分裂的誘導(dǎo)以及在其后的生長和增殖，都是的誘導(dǎo)以及在其后的生長和增殖，都是必要的物質(zhì)必要的物質(zhì)。細(xì)胞分裂素未必是。細(xì)胞分裂素未必是必需的物質(zhì)必需的物質(zhì)，然而，常常因不同的供試材料而

7、異。然而，常常因不同的供試材料而異。4 4、誘導(dǎo)條件、誘導(dǎo)條件光照光照：愈傷組織的誘導(dǎo)需弱光或不需光，在黑暗或散光條件下最好。分化、繼代培：愈傷組織的誘導(dǎo)需弱光或不需光，在黑暗或散光條件下最好。分化、繼代培養(yǎng)一般需光。此時光對器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)。養(yǎng)一般需光。此時光對器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)。溫度溫度：外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，一般采用：外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，一般采用2525- -2828的恒溫條件下培養(yǎng)。的恒溫條件下培養(yǎng)。濕度濕度：較大，以免引起培養(yǎng)基干縮。：較大，以免引起培養(yǎng)基干縮。一般雙子葉比單子葉植物及裸子植物容易；一般雙子葉比單子葉植物及裸子植物容易；二倍體種子植物，無論莖、葉、

8、花等皆易去分化，特別是形成層和薄壁細(xì)胞容易二倍體種子植物，無論莖、葉、花等皆易去分化，特別是形成層和薄壁細(xì)胞容易誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)愈傷組織。5 5、愈傷組織的形成、愈傷組織的形成從單個細(xì)胞或外植體上脫分化形成典型的愈傷組織，大致經(jīng)歷從單個細(xì)胞或外植體上脫分化形成典型的愈傷組織，大致經(jīng)歷三個時期：三個時期：起動期、分裂期和形成期起動期、分裂期和形成期；起動期，又稱為誘導(dǎo)期起動期，又稱為誘導(dǎo)期，是愈傷組織形成的起點。外植體已分，是愈傷組織形成的起點。外植體已分化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，通過脫分化起動而進(jìn)入分裂狀態(tài)，化的活細(xì)胞在外源激素的作用下，通過脫分化起動而進(jìn)入分裂狀態(tài)，并開始形成愈傷組織。

9、在誘導(dǎo)期，細(xì)胞的大小仍然和外植體時一樣，并開始形成愈傷組織。在誘導(dǎo)期，細(xì)胞的大小仍然和外植體時一樣，因此因此外觀上未見明顯變化外觀上未見明顯變化，但代謝活化了，但代謝活化了，細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝細(xì)胞內(nèi)一些大分子代謝動態(tài)已發(fā)生明顯的改變動態(tài)已發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞正積極為下一步分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。，細(xì)胞正積極為下一步分裂進(jìn)行準(zhǔn)備。 分裂期分裂期: :外植體切口邊緣開始膨大，外層細(xì)胞通過一分為二的方式進(jìn)行分裂，外植體切口邊緣開始膨大，外層細(xì)胞通過一分為二的方式進(jìn)行分裂，而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變小；細(xì)胞核和核仁增而中間的細(xì)胞不分裂。另外還有細(xì)胞數(shù)目增加，體積變??；細(xì)胞核和核仁增到最大

10、等。從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過程。這時組織到最大等。從而形成一團(tuán)具有分生組織狀態(tài)細(xì)胞的過程。這時組織細(xì)胞代謝細(xì)胞代謝十分活躍，發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。十分活躍，發(fā)生了一系列生理生化及形態(tài)的變化。 愈傷組織的特征愈傷組織的特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明。明。 形成期形成期: :是指外植體的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了具有無序結(jié)構(gòu)的愈傷組是指外植體的細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)、分裂形成了具有無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織時期。這個時期特征是細(xì)胞大小不再發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)的形成過程加速，織時期。這個時期特征是細(xì)胞大小不再發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)

11、的形成過程加速，愈傷組織表層的分裂逐漸減慢和停止，為次生生長所代替，大量次生結(jié)愈傷組織表層的分裂逐漸減慢和停止，為次生生長所代替，大量次生結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。在這時期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小往構(gòu)出現(xiàn)。在這時期中細(xì)胞的伸展和分裂處于平衡，故細(xì)胞的平均大小往往沒有變化。內(nèi)部組織細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加。往沒有變化。內(nèi)部組織細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加。愈傷組織的特征：愈傷組織的特征：生長旺盛的愈傷組織一般生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；而老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色；而老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐

12、色。色。三、愈傷組織的繼代培養(yǎng)和生長特性三、愈傷組織的繼代培養(yǎng)和生長特性愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織的繼代培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng)一段時間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼續(xù)正常生長，更換一愈傷組織培養(yǎng)一段時間后必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上以保持培養(yǎng)物的繼續(xù)正常生長，更換一次培養(yǎng)基稱一代繼代培養(yǎng)次培養(yǎng)基稱一代繼代培養(yǎng)。1 1、為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？、為什么要進(jìn)行繼代培養(yǎng)？經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基里的養(yǎng)分耗盡培養(yǎng)基已干燥培養(yǎng)基已干燥生長物已充滿培養(yǎng)瓶生長物已充滿培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物需要擴(kuò)繁培養(yǎng)物需要擴(kuò)繁瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑（因為植物組織在培養(yǎng)前幾周有時會產(chǎn)生毒素物質(zhì)

13、，這些物質(zhì)會擴(kuò)散瓊脂培養(yǎng)基褐化或發(fā)黑（因為植物組織在培養(yǎng)前幾周有時會產(chǎn)生毒素物質(zhì)，這些物質(zhì)會擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基）進(jìn)入培養(yǎng)基）需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長需要讓培養(yǎng)物在一種新的營養(yǎng)條件下生長培養(yǎng)基由于植物材料的原因使培養(yǎng)基由于植物材料的原因使pHpH降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化降低，導(dǎo)致培養(yǎng)基液化 理論上愈傷組織是可以無限制繼代，但愈傷組織繼代次數(shù)增加，形態(tài)發(fā)生能力逐漸喪失。理論上愈傷組織是可以無限制繼代，但愈傷組織繼代次數(shù)增加，形態(tài)發(fā)生能力逐漸喪失。2 2、愈傷組織繼代培養(yǎng)方式、愈傷組織繼代培養(yǎng)方式 繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)培養(yǎng)分為培養(yǎng)分為固體固體和和液體液體培養(yǎng)兩大類。培養(yǎng)兩大類。 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)又分

14、又分靜止靜止和和振蕩振蕩培養(yǎng)的二類。培養(yǎng)的二類。 愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)應(yīng)符合：愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)應(yīng)符合：（1 1）三角燒瓶容納的培養(yǎng)基占總?cè)莘e的）三角燒瓶容納的培養(yǎng)基占總?cè)莘e的20%20%30%30%，培養(yǎng)基含量可隨培養(yǎng)物量的減，培養(yǎng)基含量可隨培養(yǎng)物量的減少而減少；少而減少；（2 2）轉(zhuǎn)速一般為）轉(zhuǎn)速一般為8080100 r/min100 r/min；（3 3）細(xì)胞或愈傷組織的生長呈典型的）細(xì)胞或愈傷組織的生長呈典型的S S型曲線，即延滯期（型曲線，即延滯期（lag phaselag phase），對數(shù)生），對數(shù)生長期（長期（log phaselog phase），然后逐漸減慢，

15、直至停止。），然后逐漸減慢，直至停止。3 3、愈傷組織的生長特性、愈傷組織的生長特性一般情況下，一般情況下，2525下培養(yǎng)的愈傷組織需要每下培養(yǎng)的愈傷組織需要每4646周繼代一次。大多數(shù)研究工作周繼代一次。大多數(shù)研究工作表明，對表明，對30 ml30 ml培養(yǎng)基中愈傷組織每培養(yǎng)基中愈傷組織每2828天天繼代一次可以獲得一個保持長期分裂狀態(tài)、繼代一次可以獲得一個保持長期分裂狀態(tài)、細(xì)胞基本均一的穩(wěn)定群體。細(xì)胞基本均一的穩(wěn)定群體。第一次繼代培養(yǎng)時用無菌刀片將新鮮愈傷切下，無菌地轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上，被第一次繼代培養(yǎng)時用無菌刀片將新鮮愈傷切下，無菌地轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基上，被轉(zhuǎn)移的愈傷小塊不宜過小，否則生長會受

16、抑制。一旦愈傷建立起來，多數(shù)愈傷系需轉(zhuǎn)移的愈傷小塊不宜過小，否則生長會受抑制。一旦愈傷建立起來，多數(shù)愈傷系需要每月繼代一次。繼代時般情況下不需改變原培養(yǎng)基的成分，但很多物種需要將要每月繼代一次。繼代時般情況下不需改變原培養(yǎng)基的成分，但很多物種需要將生生長素降低些，尤其是使用長素降低些，尤其是使用2 2，4-D4-D時時。一般地，經(jīng)過繼代培養(yǎng)的愈傷組織在穩(wěn)定生長一般地，經(jīng)過繼代培養(yǎng)的愈傷組織在穩(wěn)定生長1 12 2代后，具有代后，具有S S型生長曲線。開型生長曲線。開始始一周一周生長緩慢，中間生長緩慢，中間3 3周周生長很快，生長很快，4 4周周以后生長又變遲緩。以后生長又變遲緩。第二節(jié)第二節(jié) 懸

17、浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng): :一般是把一些小塊生長旺盛的愈傷組織一般是把一些小塊生長旺盛的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，從而使愈傷放入液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，從而使愈傷組織塊變成良好分散性的組織塊變成良好分散性的細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體細(xì)胞和小的細(xì)胞聚集體。愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的比較均一愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)能產(chǎn)生大量的比較均一的細(xì)胞，而且細(xì)胞增殖速度快，適宜進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞，而且細(xì)胞增殖速度快，適宜進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞的培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的用途懸浮培養(yǎng)的用途 提供一個相對一致的細(xì)胞群體（供生化研究、胚胎發(fā)生研究、胚的同步化研提供一個相對一致的細(xì)胞群體（供生化研究、胚

18、胎發(fā)生研究、胚的同步化研究等）究等） 能快速吸收外源物質(zhì)，檢查藥效能快速吸收外源物質(zhì)，檢查藥效 研究次生代謝、酶誘導(dǎo)、基因表達(dá)、抗生素的降解的良好實驗體系研究次生代謝、酶誘導(dǎo)、基因表達(dá)、抗生素的降解的良好實驗體系 多數(shù)懸浮細(xì)胞缺乏葉綠體、色素，對酶和次生物質(zhì)的分離及純化十分有利多數(shù)懸浮細(xì)胞缺乏葉綠體、色素，對酶和次生物質(zhì)的分離及純化十分有利 細(xì)胞增殖速度快，適于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度快，適于進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng) 分離原生質(zhì)體的良好細(xì)胞來源分離原生質(zhì)體的良好細(xì)胞來源第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的分化與植株再生愈傷組織的分化與植株再生將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，它可以再生分化完成將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中

19、，它可以再生分化完成形態(tài)發(fā)生形態(tài)發(fā)生而產(chǎn)生芽根結(jié)構(gòu)的分生組織或胚狀體。繼之，由這些有結(jié)構(gòu)的組織而產(chǎn)生芽根結(jié)構(gòu)的分生組織或胚狀體。繼之，由這些有結(jié)構(gòu)的組織發(fā)育成完整的小植株。植物組織細(xì)胞離體培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生可通過發(fā)育成完整的小植株。植物組織細(xì)胞離體培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生可通過器官發(fā)生器官發(fā)生和和體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生這兩種途徑形成再生植株。這兩種途徑形成再生植株。體細(xì)胞胚胎發(fā)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生：指從體細(xì)胞進(jìn)行的類胚結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)。體細(xì)胞：指從體細(xì)胞進(jìn)行的類胚結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)。體細(xì)胞胚是一個胚是一個二極二極結(jié)構(gòu)，不物理地附著于原組織，每一個體細(xì)胞胚稱為結(jié)構(gòu)，不物理地附著于原組織，每一個體細(xì)胞胚稱為胚狀體，它可

20、以同合子胚一樣發(fā)育成植株。胚狀體，它可以同合子胚一樣發(fā)育成植株。器官發(fā)生器官發(fā)生：指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽及根是一個：指從愈傷組織形成芽及根的過程，芽及根是一個單單極性結(jié)構(gòu)極性結(jié)構(gòu)，物理地同母體組織聯(lián)結(jié)著。，物理地同母體組織聯(lián)結(jié)著。一、器官發(fā)生與植株再生方式在適合的激素濃度和配比及溫光條件下，愈傷組織細(xì)胞會發(fā)生生理代謝上在適合的激素濃度和配比及溫光條件下，愈傷組織細(xì)胞會發(fā)生生理代謝上的改變，促使細(xì)胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂逐漸的改變，促使細(xì)胞分裂部位和方向改變，首先出現(xiàn)分生細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂逐漸形成分生細(xì)胞團(tuán)和分生組織，進(jìn)一步再分化形成維管結(jié)節(jié)直至分化成芽和根等形

21、成分生細(xì)胞團(tuán)和分生組織，進(jìn)一步再分化形成維管結(jié)節(jié)直至分化成芽和根等器官。器官。可以把愈傷組織分化出芽、根器官概括為以下幾種方式可以把愈傷組織分化出芽、根器官概括為以下幾種方式：單極分化單極分化： 愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，形成愈傷組織中的分生中心在刺激物質(zhì)的影響下向著一極分化，形成有根無芽有根無芽或或者者有芽無根有芽無根的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。雙極分化雙極分化： 愈傷組織中隨著細(xì)胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心，其中有的分化芽，愈傷組織中隨著細(xì)胞分裂出現(xiàn)兩個或兩個以上分生中心，其中有的分化芽，有的分化根，根芽之間有的分化根，根芽之間并無輸導(dǎo)等組織溝通并無輸導(dǎo)等組織溝通，在培養(yǎng)

22、瓶內(nèi)靠愈傷組織提供養(yǎng)料，在培養(yǎng)瓶內(nèi)靠愈傷組織提供養(yǎng)料，這種以愈傷組織隔離著的芽和根的苗，常常不能移栽成活。這種以愈傷組織隔離著的芽和根的苗，常常不能移栽成活。先芽后根：先芽后根：愈傷組織中產(chǎn)生多個分生細(xì)胞形成分生中心，從中僅分化出芽，一般情況下待芽愈傷組織中產(chǎn)生多個分生細(xì)胞形成分生中心，從中僅分化出芽，一般情況下待芽長到一定大小時，切下移入生根培養(yǎng)基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分長到一定大小時，切下移入生根培養(yǎng)基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分化芽的培養(yǎng)基上同時在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多數(shù)植物均屬這化芽的培養(yǎng)基上同時在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多數(shù)植物

23、均屬這類正常的分化途徑，這類苗移栽較易成活。類正常的分化途徑，這類苗移栽較易成活。先根后芽：先根后芽：有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根，而后在靠近愈傷組織的根部有些植物外植體脫分化后在愈傷組織上先分化出根，而后在靠近愈傷組織的根部上再分化出芽，有的將根切下放入分化培養(yǎng)基，再于根上分化出芽器官，甚至在根上再分化出芽，有的將根切下放入分化培養(yǎng)基，再于根上分化出芽器官，甚至在根端也能分化出芽。端也能分化出芽。影響器官發(fā)生的因素影響器官發(fā)生的因素1 1、 化學(xué)因素化學(xué)因素: :高濃度的生長素和低濃度的分裂素高濃度的生長素和低濃度的分裂素可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖可以促使細(xì)胞連續(xù)繁殖無組織的生長無

24、組織的生長。高濃度的分裂素能引起高濃度的分裂素能引起莖莖- -芽芽形成。形成。生長素促進(jìn)根分化，分裂素促進(jìn)芽分化生長素促進(jìn)根分化，分裂素促進(jìn)芽分化。2 2、物理因素、物理因素光光：光照條件下：光照條件下, ,一些植物均能進(jìn)行器官發(fā)生，說明光周期并不是一些植物均能進(jìn)行器官發(fā)生，說明光周期并不是非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替條件下才能形成芽，而在非常重要的因子，可有的植物在光、暗交替條件下才能形成芽，而在連續(xù)光照下則不能。盡管如此，多數(shù)植物需要一個穩(wěn)定的光周期，多連續(xù)光照下則不能。盡管如此，多數(shù)植物需要一個穩(wěn)定的光周期，多數(shù)培養(yǎng)條件是數(shù)培養(yǎng)條件是14-16h14-16h光照，光照，8-10

25、h8-10h黑暗黑暗。光質(zhì)對于某些植物可能也很。光質(zhì)對于某些植物可能也很重要。重要。溫度溫度：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。：不同植物不一樣，需要摸索，如煙草和棉花就不一樣。3 3、外植體的生理狀態(tài)、外植體的生理狀態(tài)和成熟及高度分化的細(xì)胞相比，由和成熟及高度分化的細(xì)胞相比，由分生細(xì)胞和胚細(xì)胞分生細(xì)胞和胚細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織產(chǎn)生的愈傷組織具有較高的再生能力。具有較高的再生能力。外植體的個體外植體的個體發(fā)育年齡發(fā)育年齡和和部位、大小部位、大小 。4 4、 培養(yǎng)物的年齡培養(yǎng)物的年齡 愈傷組織在愈傷組織在增殖培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基上生長過久，致使組織衰老后移至分化培養(yǎng)上生長過久，致使組織衰老

26、后移至分化培養(yǎng)基上，往往會基上，往往會推遲推遲器官的分化。器官的分化。二、體細(xì)胞發(fā)生與植株再生在離體組織細(xì)胞培養(yǎng)形成胚狀體在離體組織細(xì)胞培養(yǎng)形成胚狀體的過程中，體細(xì)胞分裂增殖并順序的過程中，體細(xì)胞分裂增殖并順序通過通過原胚期，球形胚期，心形球形原胚期，球形胚期，心形球形胚期心形胚期，魚雷形胚期和子葉胚期心形胚期，魚雷形胚期和子葉期五個時期期五個時期，進(jìn)而形成完整的植株，進(jìn)而形成完整的植株的過程。與整體植物中受精卵的發(fā)的過程。與整體植物中受精卵的發(fā)育過程極為相似。育過程極為相似。（一）、植物胚狀體發(fā)生的普遍性（一）、植物胚狀體發(fā)生的普遍性由于培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞一般是體細(xì)胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織

27、由于培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞一般是體細(xì)胞，因而將由離體培養(yǎng)的組織細(xì)胞分化出的胚叫細(xì)胞分化出的胚叫體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚；由于離體培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞是在未經(jīng)過；由于離體培養(yǎng)的植物組織細(xì)胞是在未經(jīng)過有性過程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性細(xì)胞形成的有性過程的情況下直接產(chǎn)生胚這一結(jié)構(gòu)，并且形成的胚與性細(xì)胞形成的胚相似，因此也將此類胚稱為胚相似，因此也將此類胚稱為胚狀體胚狀體。（二）、（二）、胚狀體的概念與分類胚狀體的概念與分類胚狀體胚狀體: : 是植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)。是植物組織培養(yǎng)中起源于非合子細(xì)胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)。這個

28、定義包括下列幾點含義：這個定義包括下列幾點含義：胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無融合生殖的胚；合生殖的胚；胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于組織培養(yǎng)范圍使用，區(qū)別于無融合生殖的胚；合生殖的胚；胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽。胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)中分化的芽。無融合生殖：無融合生殖：是不經(jīng)過雌、雄性細(xì)胞融合直接由營養(yǎng)體細(xì)胞或未進(jìn)行減是不經(jīng)過雌、雄性細(xì)胞融合直接由營養(yǎng)體細(xì)胞或未進(jìn)行減數(shù)分裂的大孢子母細(xì)胞發(fā)育成的無性胚或無性種子，這種無性胚或無性數(shù)分裂的大

29、孢子母細(xì)胞發(fā)育成的無性胚或無性種子，這種無性胚或無性種子具有保持雜合性的特點，因而能夠固定雜種優(yōu)勢。種子具有保持雜合性的特點，因而能夠固定雜種優(yōu)勢。胚狀體按其來源分為兩大類胚狀體按其來源分為兩大類一類是由普通植物體（孢子體）的各種器官等雙倍體一類是由普通植物體（孢子體）的各種器官等雙倍體的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體，也稱之為的體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體，也稱之為體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚；一類是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚一類是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體，通常稱為狀體，通常稱為花粉胚花粉胚，可發(fā)育成單倍體植株。，可發(fā)育成單倍體植株。不管是那種類型的胚狀體，它都有兩個特點：不管是那種類型的胚

30、狀體，它都有兩個特點：兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚）和莖端（胚） ；它與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)無直接連系。它與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)無直接連系。植株再生通過胚狀體與器官兩種途徑的主要區(qū)別植株再生通過胚狀體與器官兩種途徑的主要區(qū)別胚狀體途徑形成的植株胚狀體途徑形成的植株器官途徑形成的植株器官途徑形成的植株細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)方向相反的兩級分化，具有根端和芽端兩個分生中心單向極性，單個分生中心不定胚維管組織與外植體維管組織不相連，是獨立“Y”字型結(jié)構(gòu)不定芽和不定根與愈傷組織的維管相連無胚胎形態(tài)， 分生中心直接分化為器官具有

31、典型的胚胎形態(tài)發(fā)生過程形成的幼苗具有子葉不定芽的苗無子葉胚狀體發(fā)育的苗，根和芽齊全一般先長芽后長根，或先長根后長芽影響胚狀體發(fā)生和發(fā)育的外部條件1 1、 植物激素植物激素（1 1） 生長素類物質(zhì)生長素類物質(zhì)在對胡蘿卜胚狀體的發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，其胚狀體的發(fā)生可分為兩個階段：在對胡蘿卜胚狀體的發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，其胚狀體的發(fā)生可分為兩個階段：第一階段第一階段包括外植體細(xì)胞的脫分化、愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)包括外植體細(xì)胞的脫分化、愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)的形成，這一階段所用的培養(yǎng)基必須含有生長素類物質(zhì)，主要是的形成，這一階段所用的培養(yǎng)基必須含有生長素類物質(zhì)，主要是2 2，4-D4-D；第二

32、階段第二階段包括胚狀體的形成和發(fā)育，這一階段必須在降低包括胚狀體的形成和發(fā)育，這一階段必須在降低2 2，4-D4-D濃度或濃度或完全去除完全去除2 2，4-D4-D的培養(yǎng)基上才能進(jìn)行。的培養(yǎng)基上才能進(jìn)行。(2) (2) 細(xì)胞分裂素類物質(zhì)細(xì)胞分裂素類物質(zhì)細(xì)胞分裂素不僅沒有誘導(dǎo)的作用細(xì)胞分裂素不僅沒有誘導(dǎo)的作用( (單獨使用不能誘導(dǎo)愈傷單獨使用不能誘導(dǎo)愈傷) ) ，而且對已，而且對已完成誘導(dǎo)的愈傷組織中胚狀體的發(fā)生還有完成誘導(dǎo)的愈傷組織中胚狀體的發(fā)生還有抑制作用抑制作用。但在除去細(xì)胞分裂素。但在除去細(xì)胞分裂素之后，胚狀體發(fā)生能力還可能部分地恢復(fù)。之后，胚狀體發(fā)生能力還可能部分地恢復(fù)。（3 3）生長素與分裂素結(jié)合使用）生長素與分裂素結(jié)合使用多數(shù)情況下多數(shù)情況下，生生長素與細(xì)胞分