小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響

1、小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響 作者：王鐵君 鄒永巍 劉林林 楊海山【摘要】 目的 觀察PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制及凋亡情況。方法 以脂質(zhì)體Lipofectimine? 2000介導(dǎo)，將PARP11308的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株，將其分為空白對(duì)照組、錯(cuò)義序列組、siRNA組，2Gy照射組、2Gy照射+錯(cuò)義序列組、2Gy照射+siRNA組。應(yīng)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制率、流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞的凋亡，并應(yīng)用RTPCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組的吸光度值與空

2、白對(duì)照組比較差異有顯著意義；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較無顯著差異；2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異。2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高。RTPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平降低。siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，與正常對(duì)照組比較差異顯著(P0.05)，并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡。結(jié)論 針對(duì)PARP1的RNAi可以提高Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率及放療引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡。 【關(guān)鍵詞】 P

3、ARP；RNAi；細(xì)胞凋亡；腫瘤細(xì)胞 聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1（PARP1）在DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、增殖分化等方面發(fā)揮著重要作用1，2，研究表明通過抑制PARP1活性可抑制PARP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)機(jī)制，提高放療和化療對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的損傷效果3，4，且腫瘤治療效果滿意。但阻斷劑技術(shù)本身存在諸多缺陷，這極大地限制其應(yīng)用于臨床腫瘤治療。而小片段干擾核糖核酸(small interference RNA，siRNA)技術(shù)能較好地解決應(yīng)用阻斷劑所帶來的問題，從而可為腫瘤放射基因治療研究提供新途徑。本文應(yīng)用PARP11308的RNAi載體轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，觀察PARP1的RNAi對(duì)小鼠L

4、ewis肺癌細(xì)胞株凋亡的影響。 1 材料與方法 1.1 材料 TRIzol Raegent、脂質(zhì)體LipofectimineTM2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌細(xì)胞株，本室保存。pGPU6/GFP/NeoParp11308，本室構(gòu)建、鑒定、篩選5。 1.2 方法 1.2.1 pGPU6/GFP/NeoParp11308轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株 取對(duì)數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107/L，取100 l接種于96孔板。設(shè)空白對(duì)照組、錯(cuò)義序列組（錯(cuò)義序列組序列與Parp1基因的siRNA序列有相同的GC

5、組成，但與小鼠的 mRNA沒有明顯的同源性，作為陰性對(duì)照）、siRNA組，2Gy照射組、2Gy照射+錯(cuò)義序列組、2Gy照射+siRNA組，每組3復(fù)孔，接種24 h后棄去上清，以脂質(zhì)體LipofectimineTM 2000介導(dǎo)，將siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株，具體操作按說明書進(jìn)行。置于37、5% CO2、無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 1.2.2 細(xì)胞抑制率檢測 在各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后分別加入MTT 20 l，培養(yǎng)箱中4 h，棄上清加入DMSO，振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。 1.2.3 轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞凋亡的檢測 各組

6、細(xì)胞以1.5×105/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化、離心收集并懸于PBS中，4、70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。 1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平的檢測 各組細(xì)胞以1.0×105/L密度接種于6孔板，24 h后 棄去上清，轉(zhuǎn)染siRNA，24 h后胰酶消化，離心收集。TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA，取1 g總RNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。以Parp1的引物5TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG3、5CTTTGCCTGCCACGCC

7、TCCAGCC3進(jìn)行RTPCR，擴(kuò)增片段為210 bp，檢測Parp1 mRNA的表達(dá)情況。以actin （5GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT3，5AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3）為內(nèi)參照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。 2 結(jié) 果 2.1 siRNA對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長的抑制作用 siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組的吸光度值與空白對(duì)照組相比差異有顯著意義(P0.05)；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義（P0.05)。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較差異無顯著性；2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射

8、組比較差異無顯著意義。2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高。 2.2 siRNA對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響 siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，與正常對(duì)照組比差異顯著（P0.05），并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡（P0.05）。 2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平 見圖1。各組210 bp處均可見清晰條帶，siRNA和2Gy照射組+ siRNA組條帶明顯減弱，各組內(nèi)參照actin條帶一致。 3 討 論 PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞(酵母除外)中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶6，在DNA 的損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、

9、細(xì)胞增殖分化調(diào)控、細(xì)胞凋亡、基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用7。PARP1活性抑制是輻射敏感性增高的主要原因，采用PARP1抑制劑可增強(qiáng)幾種抗腫瘤因子殺傷腫瘤細(xì)胞的效能。但是由于PARP是一個(gè)多成員的蛋白質(zhì)家族，化學(xué)抑制劑可能會(huì)帶來非特異性抑制效果，給特定PARP成員功能的研究帶來不便。而且PARP1特異性阻斷劑還處于實(shí)驗(yàn)階段，毒副作用仍不清楚。 siRNA是一種簡單的、有效的代替基因敲除的工具，其作用機(jī)制是通過活化的小干擾RNA靶向降解目的mRNA，從而使目的基因表達(dá)沉默。2123nt的短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA。RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基

10、因功能的研究以及多種疾病的治療，如乙型肝炎、丙肝、流感、艾滋病等810。本研究利用RNA干擾技術(shù)，將構(gòu)建的針對(duì)PARP1的RNAi裁體轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，結(jié)果表明siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組吸光度值與空白對(duì)照組比較差異顯著；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異顯著。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較無顯著差異；2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異，2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高，RTPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平降低。表明RNAi沉默PARP1基因的表達(dá)，針對(duì)PARP1的RNAi可以

11、提高Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率。 PARP具有保持染色體結(jié)構(gòu)完整、參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。PARP在DNA損傷斷裂時(shí)被激活，作為DNA損傷的分子感受器，識(shí)別、結(jié)合到DNA斷裂處，激活、催化受體蛋白的聚ADP核糖基化作用，參與DNA的修復(fù)。PARP與組蛋白H1結(jié)合，影響核小體的正常結(jié)構(gòu)，使染色體形成開放、松散結(jié)構(gòu)，有利于DNA修復(fù)11。本研究中siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，與正常對(duì)照組比較差異顯著，并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡。表明針對(duì)PARP1的RNAi可以提高放療引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡。R

12、NAi不僅克服了PARP1抑制劑的毒副作用，還具有高度特異性，為腫瘤治療治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也探索了一條新的治療途徑?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Rouleau M,Aubin RA，Poirier GG.Poly(ADPribosyl)ated chromatin domains：access grantedJ.J Cell Sci，2004；117：81525.2 Haince JF，Rouleau M，Hendzel MJ,et al.Targeting poly(ADPribosyl)ation：a promising approach in cancer therapyJ.Trends M

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