小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響_第1頁
小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響_第2頁
小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響_第3頁
小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響_第4頁
小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響_第5頁
已閱讀5頁,還剩3頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis細(xì)胞株的影響 作者:王鐵君 鄒永巍 劉林林 楊海山【摘要】 目的 觀察PARP1基因RNAi表達(dá)載體對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制及凋亡情況。方法 以脂質(zhì)體Lipofectimine? 2000介導(dǎo),將PARP11308的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株,將其分為空白對(duì)照組、錯(cuò)義序列組、siRNA組,2Gy照射組、2Gy照射+錯(cuò)義序列組、2Gy照射+siRNA組。應(yīng)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制率、流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞的凋亡,并應(yīng)用RTPCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組的吸光度值與空

2、白對(duì)照組比較差異有顯著意義;2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較無顯著差異;2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異。2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高。RTPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平降低。siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡,與正常對(duì)照組比較差異顯著(P0.05),并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡。結(jié)論 針對(duì)PARP1的RNAi可以提高Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率及放療引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡。 【關(guān)鍵詞】 P

3、ARP;RNAi;細(xì)胞凋亡;腫瘤細(xì)胞 聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(PARP1)在DNA修復(fù)、細(xì)胞死亡、增殖分化等方面發(fā)揮著重要作用1,2,研究表明通過抑制PARP1活性可抑制PARP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)機(jī)制,提高放療和化療對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的損傷效果3,4,且腫瘤治療效果滿意。但阻斷劑技術(shù)本身存在諸多缺陷,這極大地限制其應(yīng)用于臨床腫瘤治療。而小片段干擾核糖核酸(small interference RNA,siRNA)技術(shù)能較好地解決應(yīng)用阻斷劑所帶來的問題,從而可為腫瘤放射基因治療研究提供新途徑。本文應(yīng)用PARP11308的RNAi載體轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株,觀察PARP1的RNAi對(duì)小鼠L

4、ewis肺癌細(xì)胞株凋亡的影響。 1 材料與方法 1.1 材料 TRIzol Raegent、脂質(zhì)體LipofectimineTM2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清,Invitrogen公司;MTT,Sigma公司。Lewis肺癌細(xì)胞株,本室保存。pGPU6/GFP/NeoParp11308,本室構(gòu)建、鑒定、篩選5。 1.2 方法 1.2.1 pGPU6/GFP/NeoParp11308轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株 取對(duì)數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為6×107/L,取100 l接種于96孔板。設(shè)空白對(duì)照組、錯(cuò)義序列組(錯(cuò)義序列組序列與Parp1基因的siRNA序列有相同的GC

5、組成,但與小鼠的 mRNA沒有明顯的同源性,作為陰性對(duì)照)、siRNA組,2Gy照射組、2Gy照射+錯(cuò)義序列組、2Gy照射+siRNA組,每組3復(fù)孔,接種24 h后棄去上清,以脂質(zhì)體LipofectimineTM 2000介導(dǎo),將siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Lewis肺癌細(xì)胞株,具體操作按說明書進(jìn)行。置于37、5% CO2、無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6 h,更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 1.2.2 細(xì)胞抑制率檢測 在各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后分別加入MTT 20 l,培養(yǎng)箱中4 h,棄上清加入DMSO,振蕩15 min,酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。 1.2.3 轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞凋亡的檢測 各組

6、細(xì)胞以1.5×105/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,胰酶消化、離心收集并懸于PBS中,4、70%乙醇固定30 min,用含RNase及碘化丙錠(PI)的染色液染色30 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。 1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平的檢測 各組細(xì)胞以1.0×105/L密度接種于6孔板,24 h后 棄去上清,轉(zhuǎn)染siRNA,24 h后胰酶消化,離心收集。TRIzol提取各組細(xì)胞總RNA,取1 g總RNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。以Parp1的引物5TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG3、5CTTTGCCTGCCACGCC

7、TCCAGCC3進(jìn)行RTPCR,擴(kuò)增片段為210 bp,檢測Parp1 mRNA的表達(dá)情況。以actin (5GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT3,5AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3)為內(nèi)參照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。 2 結(jié) 果 2.1 siRNA對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長的抑制作用 siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組的吸光度值與空白對(duì)照組相比差異有顯著意義(P0.05);2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義(P0.05)。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較差異無顯著性;2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射

8、組比較差異無顯著意義。2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高。 2.2 siRNA對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響 siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡,與正常對(duì)照組比差異顯著(P0.05),并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡(P0.05)。 2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平 見圖1。各組210 bp處均可見清晰條帶,siRNA和2Gy照射組+ siRNA組條帶明顯減弱,各組內(nèi)參照actin條帶一致。 3 討 論 PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞(酵母除外)中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶6,在DNA 的損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、

9、細(xì)胞增殖分化調(diào)控、細(xì)胞凋亡、基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用7。PARP1活性抑制是輻射敏感性增高的主要原因,采用PARP1抑制劑可增強(qiáng)幾種抗腫瘤因子殺傷腫瘤細(xì)胞的效能。但是由于PARP是一個(gè)多成員的蛋白質(zhì)家族,化學(xué)抑制劑可能會(huì)帶來非特異性抑制效果,給特定PARP成員功能的研究帶來不便。而且PARP1特異性阻斷劑還處于實(shí)驗(yàn)階段,毒副作用仍不清楚。 siRNA是一種簡單的、有效的代替基因敲除的工具,其作用機(jī)制是通過活化的小干擾RNA靶向降解目的mRNA,從而使目的基因表達(dá)沉默。2123nt的短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA。RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基

10、因功能的研究以及多種疾病的治療,如乙型肝炎、丙肝、流感、艾滋病等810。本研究利用RNA干擾技術(shù),將構(gòu)建的針對(duì)PARP1的RNAi裁體轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株,結(jié)果表明siRNA轉(zhuǎn)染組及2Gy照射組吸光度值與空白對(duì)照組比較差異顯著;2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異顯著。錯(cuò)義序列組與正常對(duì)照組比較無顯著差異;2Gy照射組+錯(cuò)義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異,2Gy照射組+ siRNA組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率最高,RTPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞Parp1 mRNA表達(dá)水平降低。表明RNAi沉默PARP1基因的表達(dá),針對(duì)PARP1的RNAi可以

11、提高Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率。 PARP具有保持染色體結(jié)構(gòu)完整、參與DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的功能,在維持基因組穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。PARP在DNA損傷斷裂時(shí)被激活,作為DNA損傷的分子感受器,識(shí)別、結(jié)合到DNA斷裂處,激活、催化受體蛋白的聚ADP核糖基化作用,參與DNA的修復(fù)。PARP與組蛋白H1結(jié)合,影響核小體的正常結(jié)構(gòu),使染色體形成開放、松散結(jié)構(gòu),有利于DNA修復(fù)11。本研究中siRNA轉(zhuǎn)染、2Gy照射可誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡,與正常對(duì)照組比較差異顯著,并且siRNA轉(zhuǎn)染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細(xì)胞凋亡。表明針對(duì)PARP1的RNAi可以提高放療引起的腫瘤細(xì)胞的凋亡。R

12、NAi不僅克服了PARP1抑制劑的毒副作用,還具有高度特異性,為腫瘤治療治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也探索了一條新的治療途徑?!緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Rouleau M,Aubin RA,Poirier GG.Poly(ADPribosyl)ated chromatin domains:access grantedJ.J Cell Sci,2004;117:81525.2 Haince JF,Rouleau M,Hendzel MJ,et al.Targeting poly(ADPribosyl)ation:a promising approach in cancer therapyJ.Trends M

13、ol Med,2005;11:45663.3 Farmer H,McCabe N,Lord CJ,et al.Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategyJ.Nature,2005;434:91721.4 Bryant HE,Schultz N,Thomas HD,et al.Specific killing of BRCA2deficient tumours with inhibitors of poly(ADPribose) polymeraseJ. Nature,2005;43

14、4:9137.5 王鐵軍,韓成敏,李星花,等.小鼠PARP1基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與篩選J.中國生物制品學(xué)雜志,2009;22:1436.6 Beneke S,Bürkle A.Poly(ADPRibosyl)ation,PARP,and agingJ.Sci Aging Knowl Environ,2004;2004:15962.7 Affar EB,Dallaire AK,Castonguay V,et al.Role of poly(ADPribose) polymerase in rapid intracellular acidification induced by a

15、lkylating DNA damageJ.Proc Natl Acad Sci USA,2002;99:24550.8 Kapadia SB,BrideauAndersen A,Chisari FVInterference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAsJProc Natl Acad Sci USA,2003;100:20148.9 Qin XF,An DS,Chen IS,et alInhibiting HIVl infection in human T cells by lentiviralmediated delivery of small interfering RNA against CCR5JProc Natl Acad Sci USA,2003;100:1838.10 Ying C,De CE,Neyts JSelective inhibition of hepatitis B

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論