原位雜交實(shí)驗(yàn)

1、熒光原位雜交（FISH）的實(shí)驗(yàn)步驟    FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理是，按照兩個(gè)核酸的堿基序列互 補(bǔ)原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定 量。試驗(yàn)方法如下：1）玻片處理 （a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1%鹽酸浸泡24h，

2、再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。 （b）硅化處理：玻片和蓋玻片1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸煮沸10min，烘干，錫紙包好4保存?zhèn)溆谩?#160;（c）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中10min，然后60烘干過夜備用。 （d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡處理(37、2h，室溫過夜)，高壓消毒去除DEPC，然后250烘干4h以上或200過夜。稱量試劑勺也 要干烤。塑料器皿最好用滅菌的一次性塑料用品，使用前進(jìn)行高壓消毒，為保證質(zhì)量，凡使用的槍頭、試管等

3、均經(jīng)0. 5mL/L DEPC水溶液處理3h以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進(jìn)口已處理的無RNase和DNase的槍頭、試管可不必處理直接使用。（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用1mL/L DEPC水配制。2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：（a）緩沖溶液    1×PBS緩沖溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超純水；    3×PBS緩沖溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入100

4、0mL超純水；    通常配制成10×PBS的儲(chǔ)備液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）    稱取2gPFA加入30ml約60的熱水，滴幾滴20%NaOH放在磁力攪拌器攪拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3×PBS緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用HCl調(diào)整至中性（7.2左右），拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水，定容在50ml。用 0.45微米的膜過濾后使用。（室溫或4保存?zhèn)溆茫?。注意?#160;&

5、#160;  1、配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；    2、加熱時(shí)，溫度不宜過高，常為6065，否則，PFA降解失效；    3、配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。    4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對形態(tài)保持也較好。樣品固定時(shí)間在23小時(shí)，RNA含量較為恒定。過度延長固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生

6、物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。（c）配制50%，80%，98%無水乙醇溶液，每個(gè)總量20mL。（d）DAPI溶液    用1mlddH2O將DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量DAPI水溶液加到PBS中，制備成1050 µM的DAPI溶液。3）取樣及保存方法（a）反應(yīng)器沉淀前取樣25mL至離心管。（b）離心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸餾水重復(fù)兩次）。（c）樣品加入1mL多聚甲醛，搖勻，4下放置3h。（d

7、）樣品離心(12000r/min)5min，去上清夜。（e）加入1×PBS，搖勻，離心(10000r/min)5min，去上清夜（重復(fù)3次）。（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL無水乙醇，搖勻，-20保存（可保存6個(gè)月）。4）樣品固定：    稀釋樣品35倍，對樣品進(jìn)行超聲處理（3W超聲23min，沉降1min，去沉淀物，5W超聲5min），將活性污泥絮體打散成單個(gè)細(xì)胞以便于顯微鏡 計(jì)數(shù)。然后取3L樣品涂于包埋明膠的玻片上（檢查樣片本底），37的熱烘箱固定2h（或者在空氣中干燥2h或者過夜）。依次用50%、80%、98% （質(zhì)量比）乙醇浸

8、漬3min，對細(xì)胞進(jìn)行脫水后，立放，并進(jìn)行干燥。5）樣品雜交    試驗(yàn)所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗緩沖液（Washing Buffer, WB），其組分如表1-1和表1-2。表1-1 雜交緩沖液（Hybridization Buffer） 5%10%20%30%35%40%0.05%SDS（L）1.21.21.21.21.21.250mMTri-HCl（L）2424242424245mol NaCl（mL）4.324.324.324.324.324.32甲酰胺（mL）1.22.44.87.28.

9、49.6蒸餾水（mL）18.454817.254814.854812.454811.254810.0548探針Nsm156Ntcoc206Ntspn693Nsv443Ntspa662 NSO1225 NmvNIT3表1-2 淋洗緩沖液（Washing Buffer）組分體積0.05%SDS0.6L50m MTri-HCl12L5mol NaCl2.16mL蒸餾水42.8274mL（a）吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46雜交爐中放置數(shù)分鐘。（b）吸取10L探針貯存液和80L雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入46雜交爐中預(yù)熱數(shù)分鐘；探針貯

10、存液濃度為25ng/L，用無菌水稀釋購買的探針，實(shí)驗(yàn)用的探針序列及雜交條件見表1-3所示。表1-3用于檢測樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件探針探針序列(53)標(biāo)記細(xì)菌種屬濃度a NSO1225CGCCATTGTATTACGTGTGAAmmonia oxidizing beta-proteobacteria35 Nsv443CCGTGACCGTTTCGTTCCGNitroso-spira, -lobus, -vibrio30 NmvTCCTCAGAGACTACGCGGNitroso-coccus35 Ntspa662GGAATTCCGCGCTC

11、CTCTNitrospira35 NIT3CCTGGCTCCATGCTCCGNitrobacter40 Ntcoc206CGGTGCGAGCTTGCAAGCNitrococcus mobilis10 Ntspn693TTCCCAATATCAACGCATTNitrospina gracilis20 注：（a） 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）（c）吸取9L預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46下進(jìn)行雜交（黑暗中進(jìn)行），雜交時(shí)間為23h；（d）雜交后的洗脫：打開恒溫水浴槽，加熱到48，對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48水浴20min后用4冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺(tái)中揮干。DAPI染色    每孔滴9uLDAPI，4暗處5min，4冰水（BPS緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有360 nm激發(fā)波長，460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細(xì)胞計(jì)數(shù)。封片    涂封片劑，蓋蓋