第八章高效液相色譜分析

1、生物工業(yè)分析生物工業(yè)分析第八章高效液相色譜法第八章高效液相色譜法 教學(xué)目的與要求教學(xué)目的與要求 掌握高效液相色譜分析的原理；掌握高效液相色譜分析的原理；熟悉高效液相色譜分析的操作條件熟悉高效液相色譜分析的操作條件 教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn) 理解掌握高效液相色譜分析的理解掌握高效液相色譜分析的原理和操作條件的選擇原理和操作條件的選擇 教學(xué)方法教學(xué)方法 課堂講授與自學(xué)相結(jié)合課堂講授與自學(xué)相結(jié)合 教學(xué)內(nèi)容教學(xué)內(nèi)容 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 1.1 高效液相色譜法分類：高效液相色譜法分類： 依據(jù)依據(jù)分離機(jī)理的不同分離機(jī)理的不同，主要分為五類：，主要分為五類： 分配色譜：分配色譜： 吸附色譜：吸附色譜

2、： 離子交換色譜：離子交換色譜： 體積排阻色譜：體積排阻色譜： 親和色譜：親和色譜： 依據(jù)使用的依據(jù)使用的固定相和流動(dòng)相相對(duì)極性的大小不同固定相和流動(dòng)相相對(duì)極性的大小不同，分為：，分為： 正相色譜正相色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性：流動(dòng)相極性小于固定相極性 反相色譜反相色譜：流動(dòng)相極性大于于固定相極性：流動(dòng)相極性大于于固定相極性凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 1.2 高效液相色譜法特點(diǎn)：高效液相色譜法特點(diǎn)： 高效高效: 高壓高壓: 高速高速: 高靈敏度：高靈敏度： 1.3 方法的局限性：方法的局限性： 分析成本高于氣相色譜法，且易引起環(huán)境污染分析成本高于氣相色譜法，且易引起環(huán)

3、境污染 不能完全替代氣相色譜法，無(wú)法達(dá)到柱效高達(dá)不能完全替代氣相色譜法，無(wú)法達(dá)到柱效高達(dá)10萬(wàn)塊理論萬(wàn)塊理論塔板數(shù)以上的要求塔板數(shù)以上的要求 不能完全代替中、低壓柱色譜法不能完全代替中、低壓柱色譜法 1.4 高效液相色譜法與氣相色譜法的比較高效液相色譜法與氣相色譜法的比較 表表8-1 高效液相色譜法與氣相色譜法的比較高效液相色譜法與氣相色譜法的比較項(xiàng)目項(xiàng)目高效液相色譜法高效液相色譜法氣相色譜法氣相色譜法應(yīng)用應(yīng)用范圍范圍可分析低分子量、低沸點(diǎn)樣品；高可分析低分子量、低沸點(diǎn)樣品；高沸點(diǎn)、高分子有機(jī)物；離子型無(wú)機(jī)沸點(diǎn)、高分子有機(jī)物；離子型無(wú)機(jī)化合物；熱不穩(wěn)定，具有生物活性化合物；熱不穩(wěn)定，具有生物活

4、性的生物樣品的生物樣品可分析低分子量、低沸點(diǎn)有機(jī)化可分析低分子量、低沸點(diǎn)有機(jī)化合物；永久性氣體；配合程序升合物；永久性氣體；配合程序升溫可分析高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；配溫可分析高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；配合裂解技術(shù)可分析高聚物合裂解技術(shù)可分析高聚物儀器儀器組成組成要求要求溶質(zhì)在液相的擴(kuò)散系數(shù)很小，故在溶質(zhì)在液相的擴(kuò)散系數(shù)很小，故在色譜柱以外的死空間應(yīng)盡量小，以色譜柱以外的死空間應(yīng)盡量小，以減少柱外效應(yīng)對(duì)分離效果的影響減少柱外效應(yīng)對(duì)分離效果的影響溶質(zhì)在氣相的擴(kuò)散系數(shù)大，故柱溶質(zhì)在氣相的擴(kuò)散系數(shù)大，故柱外效應(yīng)的影響小，對(duì)毛細(xì)管氣相外效應(yīng)的影響小，對(duì)毛細(xì)管氣相色譜應(yīng)盡量減小柱外效應(yīng)對(duì)分離色譜應(yīng)盡量減小柱外效應(yīng)對(duì)分

5、離效果的影響效果的影響流動(dòng)流動(dòng)相相1 1 流動(dòng)相可為離子型、極性、非極流動(dòng)相可為離子型、極性、非極性、弱極性溶液，可與被分析樣品性、弱極性溶液，可與被分析樣品產(chǎn)生相互作用，并能改善分離的選產(chǎn)生相互作用，并能改善分離的選擇性；擇性； 2 2 液體流動(dòng)相動(dòng)力粘度為液體流動(dòng)相動(dòng)力粘度為1010-3 -3 PaPas s，輸送流動(dòng)相壓力高達(dá)，輸送流動(dòng)相壓力高達(dá)2-20MPa2-20MPa1 1 氣體流動(dòng)相為惰性氣體，不與氣體流動(dòng)相為惰性氣體，不與被分析的樣品發(fā)生相互作用；被分析的樣品發(fā)生相互作用；2 2 氣體流動(dòng)相粘度為氣體流動(dòng)相粘度為1010-5 -5 PaPas s，輸送流動(dòng)相壓力僅為輸送流動(dòng)相壓

6、力僅為0.1-0.5MPa0.1-0.5MPa檢測(cè)器檢測(cè)器選擇性檢測(cè)器：選擇性檢測(cè)器：UVD、PDAD、FD、ECD通用型檢測(cè)器：通用型檢測(cè)器：ELSD、RID選擇性檢測(cè)器：選擇性檢測(cè)器：NPD、FPD、ECD 通用型檢測(cè)器：通用型檢測(cè)器：TCD、FID固定相固定相分離機(jī)理：可依據(jù)吸分離機(jī)理：可依據(jù)吸附、分配、篩析、離附、分配、篩析、離子子交換、親和等多種原交換、親和等多種原理理進(jìn)行樣品分離，可供進(jìn)行樣品分離，可供選選用的固定相種類繁多用的固定相種類繁多 2.色譜柱：固定相粒度色譜柱：固定相粒度小小，為，為5-10um；填充柱；填充柱內(nèi)內(nèi)徑徑3-6mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)10-25cm ,柱效柱效10

7、3-104；毛細(xì)管；毛細(xì)管內(nèi)內(nèi)徑徑0.01-0.03mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)5-10m，柱效，柱效104-105；柱；柱溫為常溫溫為常溫1. 分離機(jī)理：可依據(jù)吸附、分離機(jī)理：可依據(jù)吸附、分配、兩種原理進(jìn)行樣品分分配、兩種原理進(jìn)行樣品分離，可供選用的固定相種類離，可供選用的固定相種類較多較多 2.色譜柱：固定相粒度大，色譜柱：固定相粒度大，為為0.1-0.5mm；填充柱內(nèi)徑；填充柱內(nèi)徑1-4mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)1-4m,柱效柱效102-103；毛細(xì)管內(nèi)徑；毛細(xì)管內(nèi)徑0.1-0.3mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)10-100m，柱效，柱效103-104；柱溫為常溫至；柱溫為常溫至300高效液相色譜分析高效液相色譜分析 第二節(jié)

8、基本原理第二節(jié)基本原理一、液相色譜過(guò)程一、液相色譜過(guò)程 1 1流程圖流程圖 高效液相色譜的流程如圖高效液相色譜的流程如圖8-18-1所示。高壓泵輸送流動(dòng)相和所示。高壓泵輸送流動(dòng)相和試樣組分高速流過(guò)色譜分離柱試樣組分高速流過(guò)色譜分離柱時(shí)，具有時(shí)，具有不同分配系數(shù)不同分配系數(shù)的組分的組分在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡時(shí)被分離，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)平衡時(shí)被分離，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)被檢測(cè)并給出信號(hào)。被檢測(cè)并給出信號(hào)。 高壓泵是高效液相色譜的動(dòng)力高壓泵是高效液相色譜的動(dòng)力源，用來(lái)使液體流動(dòng)相高速通過(guò)色源，用來(lái)使液體流動(dòng)相高速通過(guò)色譜分離柱以達(dá)到快速分析的目的。譜分離柱以達(dá)到快速分析的目的。在

9、高效液相色譜中，通常使用往在高效液相色譜中，通常使用往復(fù)復(fù)式柱塞泵。式柱塞泵。進(jìn)樣裝置：注射器，六通閥，自動(dòng)進(jìn)樣裝置：注射器，六通閥，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣器梯度淋洗梯度淋洗就是流動(dòng)相中含有就是流動(dòng)相中含有兩種或多種不同極性的溶劑兩種或多種不同極性的溶劑，在，在分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，使使被分離組分在兩相中的被分離組分在兩相中的分配系數(shù)改變分配系數(shù)改變，達(dá)到，達(dá)到提高分離效果，調(diào)節(jié)提高分離效果，調(diào)節(jié)出峰時(shí)間出峰時(shí)間的目的。兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)：的目的。兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)：外梯度外梯度（也稱低壓梯度）和（也稱低壓梯度）和內(nèi)梯度內(nèi)梯度

10、（也稱高壓梯度），外梯度是在常壓下，按一定程序?qū)⑷埽ㄒ卜Q高壓梯度），外梯度是在常壓下，按一定程序?qū)⑷軇┗旌虾笤偻ㄟ^(guò)高壓泵輸入色譜柱；內(nèi)梯度是利用兩臺(tái)高壓輸液劑混合后再通過(guò)高壓泵輸入色譜柱；內(nèi)梯度是利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。后進(jìn)入色譜柱。 高效液相色譜的分離柱具有很高的柱效，理高效液相色譜的分離柱具有很高的柱效，理論塔板數(shù)達(dá)每米論塔板數(shù)達(dá)每米3萬(wàn)。柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)萬(wàn)。柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)準(zhǔn)填充柱內(nèi)徑為準(zhǔn)填充柱內(nèi)徑為3.9或或4.6mm，柱長(zhǎng)柱長(zhǎng)1015cm，填料粒度填料粒度

11、5-10um時(shí)柱效可達(dá)時(shí)柱效可達(dá)5000-10000塊塊/m的理的理論塔板數(shù)。液相色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是論塔板數(shù)。液相色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒減小填料粒度和柱徑以提高柱效度和柱徑以提高柱效，因此柱較短。，因此柱較短。高效液相色譜檢測(cè)器高效液相色譜檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器(UVD)：應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器：應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，對(duì)流量和溫度對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫可用于梯度洗脫。只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)。只能檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì) 電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器(ECD)：選擇性檢測(cè)器，用于檢測(cè)陰、陽(yáng)離子。：選擇性檢測(cè)器，用于檢測(cè)陰、陽(yáng)離子。折射率檢測(cè)器（折射率檢測(cè)器（RI

12、D,又稱差示折光檢測(cè)器）又稱差示折光檢測(cè)器），通用型檢測(cè)器通用型檢測(cè)器，對(duì)溫度變化敏感，不能用于梯度洗脫對(duì)溫度變化敏感，不能用于梯度洗脫。 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器(FD):高靈敏度選擇檢測(cè)，不宜作為一般的檢測(cè)器使高靈敏度選擇檢測(cè)，不宜作為一般的檢測(cè)器使用。用。 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CD)：是一種高靈敏度的檢測(cè)器。：是一種高靈敏度的檢測(cè)器。 蒸發(fā)散射光檢測(cè)器（蒸發(fā)散射光檢測(cè)器（ELSD）：是一種通用型檢測(cè)器。適用于）：是一種通用型檢測(cè)器。適用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，主要用于檢測(cè)糖類、高級(jí)脂肪酸、揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，主要用于檢測(cè)糖類、高級(jí)脂肪酸、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等。維生

13、素、氨基酸、甘油三酯及甾體等。高效液相色譜分析高效液相色譜分析 二、色譜流出曲線二、色譜流出曲線試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，經(jīng)試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次流出色譜柱，經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換為電訊號(hào)，然后用記錄儀將各組分的濃度變化記錄下來(lái)，檢測(cè)器轉(zhuǎn)換為電訊號(hào)，然后用記錄儀將各組分的濃度變化記錄下來(lái)，即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化作為縱坐標(biāo)，流出時(shí)間作即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化作為縱坐標(biāo)，流出時(shí)間作橫坐標(biāo)的，這種曲線稱為色譜流出曲線。橫坐標(biāo)的，這種曲線稱為色譜流出曲線。三、色譜中有關(guān)術(shù)語(yǔ)三、色譜中有關(guān)術(shù)語(yǔ) 高效液相色譜法的基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配

14、系數(shù)、高效液相色譜法的基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配系數(shù)、分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的，分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的，但有其不同之處。液相色譜法的流動(dòng)相為液體，氣相色譜法的流動(dòng)但有其不同之處。液相色譜法的流動(dòng)相為液體，氣相色譜法的流動(dòng)相為氣體。相為氣體。液體的擴(kuò)散系數(shù)只有氣體的萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之一、液液體的擴(kuò)散系數(shù)只有氣體的萬(wàn)分之一至十萬(wàn)分之一、液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍左右體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍左右（見(jiàn)表（見(jiàn)表8-2）。）。高效液相色譜分析高效液相色譜分析 參數(shù)參數(shù)氣體氣體液體液體擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)

15、散系數(shù) D Dm m/cm/cm2 2ss-1-11010-1-11010-5-5密度密度 /gcm/gcm-1-11010-3-31 1粘度粘度 /g/g（cmscms）-1-11010-4-41010-2-2表表 8-2影響峰擴(kuò)散的主要物理性質(zhì)影響峰擴(kuò)散的主要物理性質(zhì) 高效液相色譜分析高效液相色譜分析 第三節(jié)液相色譜操作第三節(jié)液相色譜操作1 1、 操作條件的選擇操作條件的選擇 在高效液相色譜中，液體流在高效液相色譜中，液體流動(dòng)相的分子量要比氣相色譜中的動(dòng)相的分子量要比氣相色譜中的氣體流動(dòng)相的分子量大得多，由氣體流動(dòng)相的分子量大得多，由于被測(cè)組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系于被測(cè)組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系

16、數(shù)數(shù)D Dm m與流動(dòng)相的分子量成反比，與流動(dòng)相的分子量成反比，因此速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)因此速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng) B/uB/u較小，可以忽略不計(jì)，故只較小，可以忽略不計(jì)，故只有兩項(xiàng)，即有兩項(xiàng)，即 HACu液相色譜與氣相色譜兩者的液相色譜與氣相色譜兩者的H-u曲線的形狀不同，如圖曲線的形狀不同，如圖8-2所示。所示。8-2高效液相色譜分析高效液相色譜分析 1.1 流速流速：在液相色譜中，被測(cè)組分分子在流動(dòng)相中的：在液相色譜中，被測(cè)組分分子在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)比氣相中小擴(kuò)散系數(shù)比氣相中小45個(gè)數(shù)量級(jí)，當(dāng)流速大于個(gè)數(shù)量級(jí)，當(dāng)流速大于0.5cms-l時(shí)，時(shí)， H-u曲線是一段斜率不大的直線。曲線是

17、一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流速仍是一個(gè)調(diào)整分離度高不是很大。但在實(shí)際操作中，流速仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要的可選擇參數(shù)。和出峰時(shí)間的重要的可選擇參數(shù)。 1.2 固定相固定相液液-液分配色譜法固定相液分配色譜法固定相 全多孔型擔(dān)體：可由氧化鋁、氧化硅、硅藻土制成全多孔型擔(dān)體：可由氧化鋁、氧化硅、硅藻土制成 表面多孔型擔(dān)體：試樣容量低，需配較高靈敏度檢測(cè)器表面多孔型擔(dān)體：試樣容量低，需配較高靈敏度檢測(cè)器 化學(xué)鍵合固定相：目前應(yīng)用最廣泛的固定相。化學(xué)鍵合固定相：目前應(yīng)用最廣泛的固定相。液液-固吸附色譜法固吸附色譜法 吸附劑有硅膠、氧化鋁、

18、分子篩、聚酰胺等。仍可分為吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。仍可分為全多孔型和薄殼型。全多孔型和薄殼型。 1.3 流動(dòng)相流動(dòng)相 選擇流動(dòng)相時(shí)選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意下列幾個(gè)問(wèn)題應(yīng)注意下列幾個(gè)問(wèn)題： （1）流動(dòng)相純度流動(dòng)相純度 一般采用色譜純?cè)噭?，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)一般采用色譜純?cè)噭乐刮⒘侩s質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。 （2）避免使用會(huì)引起柱效降低或保留特性變化的溶劑避免使用會(huì)引起柱效降低或保留特性變化的溶劑。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁吸附劑固定相等如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁吸附劑固定相等 （3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解

19、度，試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積并在柱中沉積 （4）溶劑粘度要?。┤軇┱扯纫?（5）應(yīng)與檢測(cè)器相匹配應(yīng)與檢測(cè)器相匹配 當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。應(yīng)有紫外吸收。高效液相色譜分析高效液相色譜分析 流動(dòng)相的極性流動(dòng)相的極性：在液液色譜中，為了避免固定液的流失，一般來(lái)說(shuō)，在液液色譜中，為了避免固定液的流失，一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于親水性固定液常對(duì)于親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性，即流動(dòng)相的極性固定相的極性，這種情況稱為正相固定相的極性，這種情況稱為正相液液色譜法，極性柱也稱為正相柱。反之，為反相

20、液液色譜，非極性柱也液液色譜法，極性柱也稱為正相柱。反之，為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。對(duì)于目前常用的化學(xué)鍵合固定相來(lái)說(shuō)，固定液的流失大大減稱為反相柱。對(duì)于目前常用的化學(xué)鍵合固定相來(lái)說(shuō)，固定液的流失大大減小，流動(dòng)相的選擇范圍則要大得多。小，流動(dòng)相的選擇范圍則要大得多。常用溶劑的極性（由小到大）順序如常用溶劑的極性（由小到大）順序如下下： 庚烷、己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、庚烷、己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丁酮、四氫呋喃、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酰胺、水。正丁醇、丁酮、四氫呋喃、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酰胺、水。 為獲得合適的溶劑強(qiáng)度（極性），為獲得合適的溶劑強(qiáng)度（極性），常采用二元或