PCR實驗及結果分析（課堂PPT）

1、.1.2.3PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長.4PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物.5PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAG

2、CTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶.6PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明 1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。 但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了.7PCR技術簡史DNA的復制核

3、酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coli DNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎.8PCR技術簡介-定義 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 PCR技術是一種體外模擬自然技術是一種體外模擬自然DNA復制過程的復制過程的核酸

4、擴增技術，亦稱為無細胞分子克隆技術。它核酸擴增技術，亦稱為無細胞分子克隆技術。它是以待擴增的兩條是以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導下，通過耐高溫成的寡核苷酸引物的介導下，通過耐高溫DNA聚聚合酶的酶促作用，快速特異地擴增出特定的合酶的酶促作用，快速特異地擴增出特定的DNA片斷。片斷。 簡單的講，簡單的講， PCR技術即通過引物延伸核酸的某技術即通過引物延伸核酸的某個區(qū)域而進行的重復雙向個區(qū)域而進行的重復雙向DNA合成。合成。.9.10.11 PCR擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5端之間，是

5、需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產物片段”則以算術倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反

6、應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。 .12PCR技術簡介PCR反應所用酶：反應所用酶： 早期的早期的PCR方法采用大腸桿菌方法采用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片斷催化退火的寡核苷酸引物進行延伸反片斷催化退火的寡核苷酸引物進行延伸反應。由于該酶會在進行應。由于該酶會在進行DNA變性的溫度下失活，變性的溫度下失活，所以在每一輪合成反應中都須重新加所以在每一輪合成反應中都須重新加1份酶。并份酶。并且在擴增較長模板是效果不夠理想，產率較低，且在擴增較長模板是效果不夠理想，產率較低，有一些錯配，導致產物大小不均一。有一些錯配，導致產物大小不均一。 耐熱耐熱DNA

7、聚合酶是從一種嗜熱細菌嗜熱水聚合酶是從一種嗜熱細菌嗜熱水生菌種提純出來的，經(jīng)生菌種提純出來的，經(jīng)95持續(xù)溫育仍有活性，持續(xù)溫育仍有活性，不會在加熱變性中失活，故無需每輪反應都重新不會在加熱變性中失活，故無需每輪反應都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在更高溫度下進行，使引物和模板間的誤配大大減更高溫度下進行，使引物和模板間的誤配大大減少，提高了擴增反應的特異性和產率，并且可以少，提高了擴增反應的特異性和產率，并且可以擴增更長的產物。擴增更長的產物。.13()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20.14.151

8、234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍.16.17 PCR中后期，隨著目的DNA擴展產物逐漸積累，酶的催化反應趨于飽和，DNA擴增產物的增加減慢，進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即為停滯效應，又稱平臺期。.18操作方法 1 在PCR反應管中加入buffer2.5ul 2 向PCR加入dntp0.5ul 3 加入primer 0.5ul 4 加入模板0.5ul 5 加酶0.5ul 6 加水20.5u

9、l，至總體積為25微升？按緊蓋子， 輕輕混勻， 放入PCR儀 如何加樣才能加得準？.195 反應條件 942-5分鐘 94 40sec 57 40sec 72 1min 30sec 72 10min30-35cycle.20電泳緩沖液的配制 50TAE Buffer 配制方法： 1 稱量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L燒杯中； 2 向燒杯中加入約800ml去離子水，充分攪拌均勻； 3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH調pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。 使用時稀釋50倍 即1TAE Buffer 1.5%.21電泳 按照5份PC

10、R產物與一份6loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入膠中，其中一孔加一份Marker對照，電泳，電壓120，電泳半個小時，放入EB染色液中，染色半個小時，。.22PCR技術簡介 PCR常見問題：常見問題：一一.出現(xiàn)假陰性；出現(xiàn)假陰性；二二.出現(xiàn)假陽性；出現(xiàn)假陽性；三三.出現(xiàn)非特異性擴增帶；出現(xiàn)非特異性擴增帶；四四.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。.23PCR技術簡介一一.PCR出現(xiàn)假陰性原因：出現(xiàn)假陰性原因： 1模板因素：模板因素： 2酶失活：酶失活： 3引物：引物： 4Mg2+濃度：濃度： 5反應體積的改變：反應體積的改變： 6物理原因：物理原因： 7靶序列變

11、異：靶序列變異：.24PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 模板因素：模板因素：（1）模板中含有雜蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制劑；（3）模板中蛋白質殘留， 特別是染色體中的組蛋 白殘留；（4）提取制備模板時丟失過多；（5）模板核酸變性不徹底。.25PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 模板因素引起假陰性解決方案：模板因素引起假陰性解決方案：1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;2.提取程序固定,不宜隨意改動；3.模板DNA的溶解液應固定不變。.26PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 酶失活：酶失活：1.酶本身的質量

12、問題(供應商的問題）；2.酶存放時間太長；3.酶存放方式不當，或其他意外原因；4.忘記添加Taq酶。.27PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 酶失活引起假陰性解決方案：酶失活引起假陰性解決方案：1.檢查加樣程序及過程，看是否忘記加Taq酶；2.更換新的Taq酶;3.新舊兩種Taq酶同時使用。.28PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 引物：引物：1.引物質量；2.引物濃度；3.兩條引物的濃度是否對稱等。 .29PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 引物引起假陰性解決方案引物引起假陰性解決方案:1.選定一個好的引物合

13、成單位選定一個好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看引物濃度不僅要看OD值，稀釋時更要平衡其摩爾值，稀釋時更要平衡其摩爾濃度；濃度；3.引物應高濃度小量分裝保存，防止反復凍融或長引物應高濃度小量分裝保存，防止反復凍融或長期冷凍保存，導致引物的變質降解失效，也可要期冷凍保存，導致引物的變質降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；求合成單位將固體分裝；4.引物設計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物設計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。引物之間形成二聚體等。.30PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 Mg2+濃度：濃度： Mg2+濃度對濃度對PCR擴

14、增效率影響極大，擴增效率影響極大，濃度過高可降低濃度過高可降低PCR擴增的特異性；擴增的特異性；濃度過低則影響濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使擴增產量甚至使PCR擴增失敗，出現(xiàn)假陰性。擴增失敗，出現(xiàn)假陰性。.31PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 Mg2+濃度引起假陰性解決方案：濃度引起假陰性解決方案： 設置一組反應，其中每一反應設置一組反應，其中每一反應中的其他離子濃度相同（如中的其他離子濃度相同（如Tris.Cl,KCl等），而等），而MgCl2濃度不濃度不同（由同（由0.56mmol/L,每次增加每次增加0.5mmol/L)，由此來摸索最佳，由此來摸索最佳M

15、g2+濃度。濃度。.32PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 反應體積的改變：反應體積的改變： 做小體積做小體積PCR后，再做大體積時，后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，而非簡單地將一定要重新摸索條件，而非簡單地將反應體系中的各個成分加大幾倍，否反應體系中的各個成分加大幾倍，否則易失敗。則易失敗。.33PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 物理原因：物理原因：1.變性溫度低，變性時間短；變性溫度低，變性時間短；2.退火溫度過高，影響引物與模板的結退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低合而降低PCR擴增效率；擴增效率；3.延伸時間過短等。

16、延伸時間過短等。.34PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 物理原因引起假陰性解決方案：物理原因引起假陰性解決方案：1.提高變性溫度，延長變性時間，特別是首次循環(huán)，必要時可設為95 ，10min，或PCR反應以前在開水中煮沸幾分鐘。2.退火溫度應根據(jù)Tm值來設定，也可首先將退火溫度設為45 ，然后再逐次提高（以2 /次為宜）。3.延伸溫度以1000bp/min足夠，必要時也可適當延長，特別是末次循環(huán)，一定要延伸10min。.35PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案方案 靶序列變異：靶序列變異： 靶序列變異導致假引性的情況常靶序列變異導致假引性的情

17、況常常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異性引物與之結合部的中間，使引物失性引物與之結合部的中間，使引物失效。效。 解決方案：解決方案： 根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設計引根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設計引物。物。.36PCR技術簡介技術簡介二二.PCR出現(xiàn)假陽性原因：出現(xiàn)假陽性原因：1.引物設計不合適；2.靶序列或擴增產物的交叉污染。（1）整個基因組或大片段的污染；（2）空氣中的小片斷核酸污染。 .37PCR出現(xiàn)假陽性原因分析及解決方案 引物設計不合適：引物設計不合適： 1.選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，從而擴增出非目的性序列的PCR產物。2.靶序列太短或引物太短

18、導致特異性不強。 解決方案：解決方案： 選擇特異性強的區(qū)段設計引物。選擇特異性強的區(qū)段設計引物。.38PCR出現(xiàn)假陽性原因分析及解決方案 整個基因組或大片段的污染的解決方整個基因組或大片段的污染的解決方案：案：1.操作時小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管污染環(huán)境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應一次性使用。3.必要時，加樣本前，反應管及試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。.39PCR出現(xiàn)假陽性原因分析及解決方案 空氣中的小片斷核酸污染：空氣中的小片斷核酸污染： 這些小片斷比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，與引物互補后，擴增出PCR產物，導致假陽性出現(xiàn)。 解決方案：解決方案： 運用巢式PCR來減輕或消除。.40PCR技術簡介三三.出現(xiàn)非特異擴增帶原因：出現(xiàn)非特異擴增帶原因：1.引物與靶序列不完全互補，或引物聚合形成二聚體；2.Mg2+濃度過高，退火溫度過低，PCR循環(huán)次數(shù)過多；3.酶的質量不過關，或加Taq酶的量過多。.41PCR技術簡介 PCR出現(xiàn)非特異擴增帶解決方案：出現(xiàn)非特異擴增帶解決方案：1.必要時重新設計合成引物；必要時重新設計合成引物；2.減低酶量或調換另一來源的酶；減低酶量或調換另一來源的酶；3.