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文檔簡(jiǎn)介

1、.l碳源和氮源利用試驗(yàn) l碳水化合物的代謝試驗(yàn) l各種酶類試驗(yàn) l氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn) .l檸檬酸鹽試驗(yàn) l葡萄糖酸鹽試驗(yàn) .l原理:有些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源,分解檸檬酸鈉生成碳酸鈉,使培養(yǎng)基呈堿性。能利用檸檬酸鹽作唯一碳源的細(xì)菌,也能利用銨鹽作為唯一氮源,銨鹽被分解為氨而產(chǎn)生堿性。.l MgSO4-7H2O 0.2glNH4H2PO4 1glK2HPO4 1gl檸檬酸鈉 5gl氯化鈉 5gl瓊脂 20gl0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液 40mll蒸餾水 1000ml.結(jié)果:陽性者表面上長(zhǎng)有菌落,培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色。 .l原理:檢查細(xì)菌是否具有氧化葡萄糖作為唯一碳源,并具有還原2-酮基葡萄糖

2、酸鹽與班氏試劑混合加熱生成黃紅色酮類的能力。.l方法:接種大量待檢菌于培養(yǎng)基內(nèi),35,24-48小時(shí),0.5ml培養(yǎng)基加班氏試劑3滴左右,加熱煮沸后觀察結(jié)果。.l蛋白胨 0.15gl酵母浸膏 0.1gl磷酸二氫鉀 0.1gl葡萄糖酸鉀(或鈉)4gl蒸餾水 100ml.l結(jié)果:出現(xiàn)黃色到橙紅色沉淀為陽性,無顏色變化為陰性。 .l氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(OF試驗(yàn))l糖醇發(fā)酵試驗(yàn) lB半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG試驗(yàn)) l甲基紅試驗(yàn) lVP試驗(yàn) l 膽汁七葉苷試驗(yàn) .l 原理:細(xì)菌在分解葡萄糖的過程中,必須有分子氧參加的稱為氧化型;在無氧條件下降解葡萄糖的稱為發(fā)酵型;不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。利用此試驗(yàn)可以

3、區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。.l蛋白胨 2gl磷酸氫2鉀0.3克l氯化鈉 5gl葡萄糖 10gl0.2%溴麝香酚藍(lán)溶液 12mll瓊脂 2.5gl蒸餾水 1000ml.l方法:將待檢菌接種于二支Hugh-Leifson培養(yǎng)基的試管中,均用接種針穿至管底,其中五支加入滅菌的液體石蠟約1厘米厚。35,培養(yǎng)48小時(shí)觀察結(jié)果。培養(yǎng)基顏色變黃即為產(chǎn)酸。.l 代謝類型 加蠟封口管 開放管l發(fā)酵型 產(chǎn) 酸 產(chǎn) 酸l氧化型 不變色 產(chǎn) 酸l產(chǎn)堿型 不變色 不變色l .l原理:各種細(xì)菌因含有發(fā)酵不同糖、醇類的酶,所以分解糖、醇類的能力各不相同。分解糖、醇類后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可因菌種不同而異,有的產(chǎn)酸、產(chǎn)氣,有的僅產(chǎn)酸,故

4、用于鑒別細(xì)菌。.l蛋白胨水或肉膏湯 100mll所需的糖、醇或苷類 0.5或1gl1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 0.1ml.l 接種的細(xì)菌,若能耐分解培養(yǎng)基中的糖類產(chǎn)酸時(shí),則使培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)。若產(chǎn)氣可使半固體培養(yǎng)基內(nèi)或液體培養(yǎng)基中的倒管內(nèi)出現(xiàn)氣泡。若不分解則無變化。.l原理:有的細(xì)菌可產(chǎn)生B-半乳糖苷酶,此酶可分解鄰-硝基酚-B-D-半乳糖苷(ONPG)。ONPG為無色,經(jīng)B-半乳糖苷酶水解后,可產(chǎn)生黃色的鄰硝基酚,即使?jié)舛群艿鸵材軝z出。.l呈現(xiàn)黃色為陽性反應(yīng)。迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性,本試驗(yàn)可作為遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定方法。.l 原理:某些細(xì)菌在糖代謝過程中,分

5、解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸可進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸、乳酸等,而使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下,加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色(陽性)。 .l原理:有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少,或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(如醇、酮、醛、氣體和水),則培養(yǎng)基的酸堿度仍在6.2以上,故加入甲基紅指示劑呈黃色(陰性)。.l多價(jià)蛋白胨 7gl葡萄糖 5gl磷酸氫二鉀 5gl蒸餾水 1000ml . 方法:被檢菌接種于上述培養(yǎng)基內(nèi),于35培養(yǎng)48小時(shí),于2ml培養(yǎng)液內(nèi)加甲基紅指示劑2滴,立即觀察結(jié)果。.l結(jié)果:紅色為陽性;桔紅色為弱陽性;黃色為陰性。 .l原理:有些細(xì)菌在葡萄糖的代謝過程中生成丙酮酸,丙酮酸進(jìn)一步脫羧后可產(chǎn)

6、生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣的氧氧化為二乙酰(丁二酮),進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的精氨酸所含的胍基發(fā)生反應(yīng),生成紅色化合物,即VP反應(yīng)陽性。培養(yǎng)基中的胍基太少時(shí),加入少量含胍基的化合物,如肌酸或肌酸酐等,可加速此反應(yīng)。 . 試劑:甲液:6%a-萘酚乙醇溶液 乙液:40%氫氧化鉀溶液.l方法:將被檢菌接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后,于35培養(yǎng)48小時(shí),于2ml培養(yǎng)基內(nèi)加入甲液1ml和乙液0.4ml,振搖后觀察結(jié)果。.l結(jié)果:于數(shù)分鐘內(nèi)呈紅色為陽性;如無紅色出現(xiàn),而且于35中4小時(shí)后仍如故者即為陰性。本試驗(yàn)較為敏感。.l原理:在10-14%膽汁存在下,測(cè)定細(xì)菌水解葡萄糖苷七葉苷為七葉亭

7、和葡萄糖的能力。.l 蛋白胨 5gl 牛肉浸膏 3gl 牛膽汁(膽汁)40gl 七葉苷 1gl 檸檬酸鐵 0.5gl 瓊脂 15gl 蒸餾水 1000ml.l結(jié)果:培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蛏詈稚珵殛栃?。有生長(zhǎng)物時(shí),并不表示七葉苷裂解,僅表示膽汁濃度不能抑制D群鏈球菌外的細(xì)菌生長(zhǎng)。.l過氧化氫酶(觸酶)試驗(yàn) l氧化酶試驗(yàn) l血漿凝固酶試驗(yàn) l硝酸鹽還原試驗(yàn)l膽汁溶解試驗(yàn)l環(huán)腺苷酸(cAMP)試驗(yàn) .l原理:有些細(xì)菌具有過氧化氫酶,能將過氧化氫酶分解為水。l試劑:3%過氧化氫溶液。.l方法:玻片法:用牙簽挑取1824小時(shí)培養(yǎng)的菌苔,置于潔凈的玻片上,滴加3%過氧化氫溶液12滴。試管法:取不含血液的1824

8、小時(shí)培養(yǎng)物一接種環(huán)于試管內(nèi),加入1ml 3%過氧化氫溶液。3%過氧化氫溶液應(yīng)置于棕色瓶?jī)?nèi)冷藏。.l結(jié)果:產(chǎn)生大量氣泡為陽性,不產(chǎn)生氣泡為陰性。.l原理:凝固酶能凝固血漿纖維蛋白,是鑒定金黃色葡萄球菌的主要試驗(yàn)。本試驗(yàn)分玻片法和試管法,玻片法主要是檢測(cè)結(jié)合凝固酶,試管法是為了肯定玻片法試驗(yàn)結(jié)果和對(duì)玻片法試驗(yàn)陰性者進(jìn)行復(fù)查,檢測(cè)游離凝固酶。.l原理:結(jié)合凝固酶為金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面含有,游離凝固酶為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種胞外酶,兩酶均可作用于血漿中的纖維蛋白原,使其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,形成凝塊。. 方法:l玻片法:在玻片上加一滴滅菌生理鹽水,取葡萄球菌18-24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物一環(huán),或挑取平板上一個(gè)

9、單個(gè)菌落制成濃菌懸液,再加一接種環(huán)新鮮人或兔血漿與菌懸液混勻。同時(shí)做陽性菌和陰性菌對(duì)照試驗(yàn),立刻觀察凝塊的形成。本試驗(yàn)應(yīng)先在生理鹽水中乳化,檢查有否自凝現(xiàn)象。防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果。陽性結(jié)果一般在5-20秒內(nèi)出現(xiàn),若3-4分鐘后仍無凝固,可考慮為玻片法試驗(yàn)陰性。 .l試管法:將潔凈小試管中加0.5ml未稀釋的人或兔血漿,加0.5ml培養(yǎng)18-24小時(shí)的葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物一滿環(huán),或挑取平板上的純菌落,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)(不要搖動(dòng))試管混勻。放35水浴中4小時(shí),每隔30分鐘檢查一次有無凝固。檢查時(shí)不要振動(dòng)或搖動(dòng)試管,可輕輕將試管傾斜以觀察有無凝塊。大多數(shù)金黃色葡萄球株在354小時(shí)可以凝固血漿,如果陰性對(duì)照。枸椽

10、酸鹽抗凝的血漿可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。 . 原理:某些細(xì)菌具有氧化酶,在有氧和細(xì)胞色素C時(shí),使還原型細(xì)胞色素C氧化,氧化型細(xì)胞色素C再使二甲基對(duì)苯二胺氧化,產(chǎn)生玫瑰紅至暗紫色。有時(shí)菌落本身帶有紅色,不易觀察,可再加入a-萘酚乙醇溶液,使生成深藍(lán)色的靛酚藍(lán)。.l 試劑:l1 1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺(或四甲對(duì)苯二胺)水溶液l2 1%a-萘酚95%乙醇溶液.l 方法:取18-28小時(shí)的新鮮培養(yǎng)物,用無菌濾紙條,蘸取菌落少許,滴加1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺1-2滴,觀察結(jié)果。.l 結(jié)果:一分鐘內(nèi)出現(xiàn)紫紅色為陽性。若菌落本身有色素,則再滴加a-奈酚1-2滴,出現(xiàn)藍(lán)色則為陽性。.l原理:硝酸鹽還原反應(yīng)有兩個(gè)過程,其

11、一是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,其二是繼續(xù)將亞硝酸鹽進(jìn)一步分解為氨、氮、氧化氮等氣體終末產(chǎn)物。.l 蛋白胨 1gl 硝酸鉀 0.1gl 蒸餾水 100ml.l方法:將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中,35培養(yǎng)1-4天,將甲、乙試劑各加0.1ml于試管內(nèi),混勻觀察結(jié)果 .l 結(jié)果:出現(xiàn)紅色為陽性。如無紅色出現(xiàn),應(yīng)加少量鋅粉,如仍無紅色說明亞硝酸鹽進(jìn)一步分解成氮、氨等氣體,應(yīng)判為陽性;如加鋅粉出現(xiàn)紅色,說明還原劑鋅粉使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,待檢菌無還原硝酸鹽的能力,為陰性。.l 原理:在特定時(shí)間和溫度條件下測(cè)定膽鹽溶解細(xì)菌的能力。溶菌的機(jī)理尚未定論,有人認(rèn)為膽鹽或膽汁能激活肺炎鏈球菌的自溶酶,使菌體發(fā)生溶解。

12、.l試劑:10%去氧膽酸鈉溶液或牛膽汁 .l平板法:10%去氧膽酸鈉溶液一接種環(huán),加于血瓊脂平板的試驗(yàn)菌落上,置于35孵育30分鐘,肺炎鏈球菌菌落消失為陽性。陰性者菌落仍存在。.l 原理:B群鏈球菌(無乳鏈球菌)能產(chǎn)生一種因子(cAMP因子),這種因子在綿羊血或牛血培養(yǎng)基上與金黃色葡萄球菌-溶血素起協(xié)同作用,促進(jìn)-溶血素的活性。因此在兩種細(xì)菌的交界處溶血力增加,出現(xiàn)箭頭形溶血區(qū)。.l方法:首先在羊血平板上接種一長(zhǎng)條金黃色葡萄球菌(藥敏質(zhì)控菌)再將被檢菌與金黃色葡萄球菌接種線垂直接種一短條,兩者不能相交,應(yīng)相距3mm左右,同時(shí)在被檢菌接種線對(duì)側(cè),用同樣方法接種陰性和對(duì)照菌,35培養(yǎng)過夜,如放在C

13、O2燭缸內(nèi)結(jié)果更為好看(金黃色葡萄球菌用ATCC25923為佳)。.l結(jié)果:在被檢菌接種線與金黃色葡萄球菌接種線處出現(xiàn)一個(gè)矢狀加強(qiáng)溶血區(qū),為CAMP陽性。陰性無加強(qiáng)溶血區(qū)。 .l吲哚試驗(yàn) l硫化氫試驗(yàn) l苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) l氨基酸脫羧酶試驗(yàn)(賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸) l脲酶試驗(yàn) l明膠液化試驗(yàn) .l原理:細(xì)菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚(靛基質(zhì)),經(jīng)與試劑 中的對(duì)二甲氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚而呈紅色。.l蛋白胨(或胰胨)10-20gl氯化鈉 5gl蒸餾水 1000ml. kovac氏試劑l對(duì)二甲氨基苯甲醛 10gl純戊醇 150mll純濃鹽酸 50mll 先將試劑溶于醇中,緩慢加入鹽酸

14、即成。 .l 方法:挑取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基,于35培養(yǎng)1-2天,沿管壁徐徐加入kovac氏試劑0.5ml,使成兩層,觀察結(jié)果。.l結(jié)果:在兩者液面交界處出現(xiàn)紅色為陽性,無色為陰性。.l原理:細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)和含硫化物生成硫化氫,硫化氫遇鉛或鐵離子生成黑色的硫化物。由此間接地檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生硫化氫。 .l培養(yǎng)基:三糖鐵培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵培養(yǎng)基 .l結(jié)果:培養(yǎng)基黑為陽性,無變化為陰性。 .l原理:細(xì)菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶,能使苯丙氨酸脫去氨基生成苯丙酮酸,苯丙酮酸與鐵離子作用生成綠色絡(luò)合物。.lDL苯丙氨酸 0.2g(L苯丙氨酸0.1g)l 酵母浸膏 0.3

15、gl 氯化鈉 0.5gl 磷酸氫二鈉 0.1gl 瓊脂 1.2gl 蒸餾水 100ml.l試劑: 10%三氯化鐵溶液:將10克三氯化鐵溶于100ml蒸餾水中即成。 .l方法:將待檢菌接種于培養(yǎng)基斜面上,35培養(yǎng)24小時(shí),滴加三氯化鐵試劑,觀察結(jié)果。.l結(jié)果:培養(yǎng)基斜面上顯綠色為陽性,不變色為陰性。 .l原理:檢查細(xì)菌使氨基酸脫去羧基,生成胺類化合物,使培養(yǎng)基變堿的能力。 .l蛋白胨 5gl酵母浸膏 3gl葡萄糖 1gl6%溴甲酚紫灑精溶液 1mll蒸餾水 1000mll將上述成分溶于蒸餾水,然后加進(jìn)所需氨基酸(賴氨酸,鳥氨酸、精氨酸),使其濃度為. 。對(duì)照管不加氨基酸 。.l方法:取待檢菌接種

16、于氨基酸脫羧培養(yǎng)基和對(duì)照管中,封滅菌液體石蠟,35培養(yǎng)24小時(shí)以上觀察結(jié)果。.l培養(yǎng)基pH應(yīng)偏酸,有利于酶的形成。l加封液體石蠟造成厭氧環(huán)境,在厭氧環(huán)境下氨基酸脫羧生成的胺才穩(wěn)定,另外也可避免出現(xiàn)假陽性。 l如對(duì)照管不變色則不能判斷結(jié)果。 .l 結(jié)果:接種待檢菌的測(cè)定的培養(yǎng)基是紫色,對(duì)照管是黃色為陽性;兩管均是黃色為陰性。.l原理:某些細(xì)菌能產(chǎn)生脲酶。脲酶 可分解尿素,尿素經(jīng)分解后產(chǎn)生大量的氨,使培養(yǎng)基變堿。.l蛋白胨 1gl氯化鈉 5gl葡萄糖 1glKH2PO4 2gl20%尿素水溶液 100mll瓊脂 15gl0.1%酚紅水溶液 12mll 蒸餾水 900ml.l方法:將被檢菌接種于尿素培養(yǎng)基后,置35培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果。陰性應(yīng)觀察4天。.l結(jié)果:細(xì)菌分解尿素后培養(yǎng)基變紅為陽性,不變?yōu)殛幮浴?l原理:明膠酶是細(xì)菌產(chǎn)生的一種胞外酶,能分解明膠為氨基酸,從而失去凝固力,使半固體的明膠培養(yǎng)基成為液體。 .l于普通瓊脂中加入1%明膠即成。 .l方法:將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基,于20培養(yǎng)7天,逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。l如室溫高培養(yǎng)基自行溶

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