微生物快速檢測(cè)方法ppt課件

1、.微生物快速檢測(cè)方法簡(jiǎn)介微生物快速檢測(cè)方法簡(jiǎn)介.常見微生物檢測(cè)項(xiàng)目常見微生物檢測(cè)項(xiàng)目n常規(guī)微生物項(xiàng)目常規(guī)微生物項(xiàng)目 細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌n致病微生物項(xiàng)目致病微生物項(xiàng)目 沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等.n傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀菌落計(jì)數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過(guò)濾樣品的檢測(cè)n快速檢測(cè)的新方法快速檢測(cè)的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測(cè)量法常規(guī)微生物檢測(cè)方法常規(guī)微生物檢測(cè)方法.培養(yǎng)

2、膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測(cè)紙片技術(shù)n原理 二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。n操作方法：檢樣稀釋取1ml滴于下膜正中央蓋上膜擴(kuò)展器壓成20cm2圓圈 37培養(yǎng)24h 計(jì)數(shù)(顯色的斑點(diǎn)).培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測(cè)紙片技術(shù)n優(yōu)點(diǎn)：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時(shí)間、人力和費(fèi)用。因?yàn)橛酗@色劑和小方格，計(jì)數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動(dòng)作。可快速測(cè)試致病菌，節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)步驟。n缺點(diǎn)成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測(cè)試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時(shí)不能節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間。.培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測(cè)紙片技術(shù)n應(yīng)用細(xì)菌總數(shù)測(cè)試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認(rèn)別計(jì)數(shù)。

3、大腸菌群 測(cè)試片中含有指示劑，使菌落為紅色，且有氣泡產(chǎn)生。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色，并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡。24小時(shí)可確定大腸桿菌數(shù)。.霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)試片中加入的抗生素，可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；指示劑使酵母菌易認(rèn)別計(jì)數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個(gè)紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時(shí)可確認(rèn)結(jié)果。培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測(cè)紙片技術(shù).螺旋平板法螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀.n原理原理 樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。 當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時(shí)，菌液體積減 少，

4、注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時(shí)菌落 沿注液線生長(zhǎng)。用一計(jì)數(shù)的方格來(lái)校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的已知菌落數(shù)，在計(jì)算細(xì)菌濃度。 螺旋平板法螺旋平板法.平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法螺旋平板法.n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)方法相比，無(wú)需稀釋梯度，每個(gè)梯度倒2個(gè)平板，節(jié)省了大量人力物力。n缺點(diǎn)缺點(diǎn)檢測(cè)時(shí)間并沒(méi)有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時(shí)。需要配合自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。螺旋平板法螺旋平板法.濾膜法濾膜法n濾膜法常用于可過(guò)濾樣品的微生物檢測(cè)。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)靈敏度增大，菌落無(wú)擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。n缺點(diǎn)缺點(diǎn) 需要額外的支出

5、購(gòu)買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過(guò)程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對(duì)菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。.ATPATP生物熒光法生物熒光法n原理原理 ATP螢光素+螢光素酶+O2AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光n應(yīng)用應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測(cè)。用于水質(zhì)檢測(cè)。改良后用于食品的商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。.1010秒獲得結(jié)果秒獲得結(jié)果涂抹采樣涂抹采樣混合混合: :震蕩震蕩5s5s檢測(cè)檢測(cè)表面清潔度表面清潔度/水質(zhì)檢測(cè)水質(zhì)檢測(cè)ATPATP生物熒光法生物熒光法.nATPATP法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn)法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：大大縮短庫(kù)存時(shí)間，減少

6、物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATPATP生物熒光法生物熒光法.電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)n原理原理供細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測(cè)量管底部裝入電極插頭，即可對(duì)接種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測(cè)。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強(qiáng)了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。.M=(RM=(R0 0-R-RT T)/R)/R0 01

7、00%100% 其中R0表示開始時(shí)培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時(shí)刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小細(xì)菌活動(dòng)越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對(duì)數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測(cè)時(shí)間）呈直線關(guān)系。電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù).n優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)：電阻抗法較省力，樣品細(xì)菌數(shù)在418小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。但對(duì)于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)程中工作量較大，但以后的檢測(cè)簡(jiǎn)便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測(cè)量管一只。電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)電阻抗法測(cè)定細(xì)菌總數(shù).通過(guò)顏色變化檢測(cè)n微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化

8、，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。n與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。n缺點(diǎn)：需要購(gòu)買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。.梅里埃的梅里埃的BacT/AlertBacT/Alert微生物檢測(cè)儀微生物檢測(cè)儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測(cè)反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。.流式細(xì)胞技術(shù) n原理原理液體樣品流過(guò)儀器中的激光照射的流動(dòng)池，當(dāng)微生物流過(guò)顯微鏡聚焦的流動(dòng)池時(shí)就能被自動(dòng)地檢測(cè)到。n特點(diǎn)特點(diǎn)檢測(cè)方法與使用的儀器有高度的特異性，所以應(yīng)遵循生產(chǎn)廠商提供的方法。.nFOSSFOSS

9、公司公司BactoScan FCBactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測(cè)儀牛奶中總菌數(shù)快速檢測(cè)儀采用流式細(xì)胞原理。對(duì)微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：速度快(50-150樣品/小時(shí))缺點(diǎn)：死活細(xì)胞一起檢測(cè)，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測(cè)原奶中細(xì)菌總數(shù)。流式細(xì)胞技術(shù) .n美國(guó)美國(guó)ChemunexChemunex公司微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)公司微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測(cè)儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，速度極

10、快，處理量大。檢測(cè)步驟：1、過(guò)濾；2、標(biāo)記，直接對(duì)活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記；3、激光掃描。流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù) .三種型號(hào)的差異三種型號(hào)的差異產(chǎn) 品 型 號(hào)主 要 參 數(shù)總 活 菌 數(shù)酵 母 和 霉 菌 數(shù)大 腸 桿 菌 和 大 腸 菌 群賈 第 鞭 毛 蟲 和 隱 孢 子 蟲處 理 速 度靈 敏 度適 用 范 圍BactiflowChemScan RDIReal-time analyser D-count10-14/個(gè) 樣 品小 時(shí)100-100,000/g個(gè) 細(xì) 胞適 用 于 含 菌 量 較 高 的食 品 、 化 妝 品 及 水 等樣 品 。 每 天 檢 測(cè) 量 不大 于 個(gè) 樣 品 。4

11、0適 用 于 含 菌 量 較 低 的不 可 過(guò) 濾 的 食 品 、 化妝 品 等 樣 品 。 每 天 檢測(cè) 量 大 于 個(gè) 樣 品 。4090分 鐘 內(nèi) 出 定 量 結(jié) 果1-5000個(gè) 細(xì) 胞特 別 適 用 于 醫(yī) 藥 工 業(yè) 、 飲 用 水尤 其 是 直 飲 水 中 對(duì) 可 過(guò) 濾 的 樣品 進(jìn) 行 有 害 腸 道 菌 及 原 生 動(dòng) 物進(jìn) 行 快 速 檢 測(cè)50/個(gè) 樣 品小 時(shí)1-1000cfu/g(mL) .利用細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計(jì)而成。微生物在生長(zhǎng)和代謝的過(guò)程中，能產(chǎn)生大量的代謝熱。由于各種微生物的代謝產(chǎn)物熱效應(yīng)不同，因此可顯示出特異性的熱效應(yīng)曲線圖。熱效應(yīng)曲線圖的形成，是

12、由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個(gè)曲線峰，如為單一營(yíng)養(yǎng)成分，則只有一個(gè)峰出現(xiàn)。在細(xì)菌生長(zhǎng)的過(guò)程中，用微量量熱計(jì)測(cè)量產(chǎn)熱量等熱數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，繪制成以產(chǎn)熱量對(duì)比時(shí)間組成的熱曲線圖，以此推斷細(xì)菌存在數(shù)量。微量量熱法微量量熱法.發(fā)射測(cè)量法發(fā)射測(cè)量法利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時(shí)產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中。細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，糖被利用并放出標(biāo)記的CO2，將生成的放射性標(biāo)記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后，利用專用的放射測(cè)量?jī)x來(lái)測(cè)定放射性CO2 。放射量與菌數(shù)成正比。.致病菌快速檢測(cè)方法致病菌快速檢測(cè)方法n顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)

13、成熟，產(chǎn)品很多。n免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽(yáng)性存在，陽(yáng)性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。n分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測(cè)法和PCR法為主。n基因芯片.顯色培養(yǎng)基法顯色培養(yǎng)基法n原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)改良。利用細(xì)菌特有的生理生化反應(yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標(biāo)菌與其他菌區(qū)別開來(lái).酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀n利用熒光分析技術(shù)通過(guò)固相吸附器，用已知抗體來(lái)捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過(guò)激發(fā)光源檢測(cè)，即能自動(dòng)讀出發(fā)光的陽(yáng)性標(biāo)本。n優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，速度快，可以在48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。.分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法n基因探針?lè)癙CR方法在國(guó)外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。n有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法。n基因探針?lè)ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。nPCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)