模擬微重力環(huán)境下層狀修復(fù)體與軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、模擬微重力環(huán)境下層狀修復(fù)體與軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究         10-05-04 14:15:00     編輯：studa20            作者：張世浩，朱立新，靳安民，嚴(yán)樂平，王九現(xiàn)，黃銳，朱書濤 【摘要】  目的探討模擬微重力作為軟骨組織工程培養(yǎng)方法的作用和膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣（trical cium phosphate

2、，TCP）層狀梯度修復(fù)體作為關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的可行性。方法體外培養(yǎng)新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并擴(kuò)增,吸附于多孔膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體上，模擬微重力和普通環(huán)境下三維立體分別培養(yǎng)3周,通過生長曲線、倒置相差顯微鏡、組織學(xué)、掃描電鏡及免疫組織化學(xué)檢測微重力對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響和支架在三維立體培養(yǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞的表型、增殖及功能的影響。結(jié)果軟骨細(xì)胞/修復(fù)體體外培養(yǎng)3周,軟骨細(xì)胞模擬微重力培養(yǎng)組明顯比普通培養(yǎng)組在層狀修復(fù)體上分布均勻，修復(fù)體中心軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯較多，并分泌細(xì)胞基質(zhì)，包裹在軟骨細(xì)胞周圍，型膠原免疫組織化學(xué)染色陽性。結(jié)論模擬微重力環(huán)境有利于軟骨細(xì)胞在三維支架上的均勻增殖，有望成

3、為軟骨組織工程中的一種重要培養(yǎng)方法；膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體，細(xì)胞相容性良好,有望成為一種比較理想的關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架材料。 【關(guān)鍵詞】  微重力; 層狀修復(fù)體; 軟骨細(xì)胞; 組織工程    Abstract：ObjectiveTo evaluate the feasibility of the minic microgravity as a method and the layered cylindric collagenchitosantricalcium phosphate composite as a scaffold for t

4、he cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the chondrocytes and affects the cell behavior.MethodThe chondrocytes were isolated and multiplied in vitro,and then the chondrocytes were seeded onto the  porous collagenchitosantricalcium phosphate composite scaffold and w

5、ere cultured in both minic microgravity and ordinary environment for 3 weeks.The effects of the composite scaffold on the cell adhesivity,proliferation,morphological changes and synthesis of the extracellularmatrix were observed by the growth curve,phasecontrast microscopy,histology,scanning electro

6、n microscopy and immunohistochemistry.ResultThe chondrocytes that adhered to the scaffold increased significantly and secreted  extracellular matrix in the center of the porous scaffold around the chondrocytes under minic microgravity compared with ordinary environment.Immunohistochemistry of t

7、ype collagen was positive.ConclusionThe minic microgravity environment will be a good method for the cartilage tissue engineering.And the layered cylindric collagenchitosantricalcium  phosphate composite scaffold has a good cellular compatibility.It will be an ideal scaffold for the cartilage t

8、issue engineering.    Key words：microgravity；  layered composite；  chondrocyte；  tissue engineering    關(guān)節(jié)軟骨損傷一直是骨科面臨的難題之一。關(guān)節(jié)軟骨本身缺乏營養(yǎng)血管，再生細(xì)胞和體液因子少，軟骨的細(xì)胞/基質(zhì)比低，一旦關(guān)節(jié)軟骨損傷，其再生能力十分有限。此外，再生軟骨的生物化學(xué)和機(jī)械性能不等同于正常軟骨，容易退變和侵蝕。組織工程修復(fù)軟骨手段的目的是將修復(fù)物質(zhì)運(yùn)送到受損部位并且固定于該位置以達(dá)到有效的修復(fù) 。從

9、研究結(jié)果來看，雖然研究者們應(yīng)用了多種方法研究生物材料、種子細(xì)胞和修復(fù)，但修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的長期效果并不令人滿意，存在著組織工程軟骨中心強(qiáng)度低、難以和宿主正常軟骨整合、軟骨和軟骨下骨的斷裂分層問題等難題13。作者希望通過最近新興的模擬微重力技術(shù)，將軟骨組織工程中應(yīng)用廣泛的膠原、殼聚糖與TCP有機(jī)復(fù)合,模仿體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu),增加支架材料的力學(xué)強(qiáng)度，構(gòu)建層狀梯度復(fù)合材料，并將擴(kuò)增的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞植入其中人工培養(yǎng),觀察軟骨細(xì)胞在膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體中的黏附、增殖、生長情況及生物學(xué)性狀變化,以評(píng)價(jià)微重力培養(yǎng)方法在軟骨組織工程的實(shí)用性及該復(fù)合材料作為關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架的可行性。

10、60;   1  材料和方法     1.1  主要試劑和儀器    DMEM/F12、DHanks 、胰蛋白酶、EDTA (Sigma公司，美國)；型膠原酶(Gibco公司，美國)；胎牛血清（杭州四季青公司）；四氮唑藍(lán)（上海思吉生物制品有限公司，中國）、型膠原抗體、S-100抗體、SABC試劑盒（武漢博士德公司）；12、24孔培養(yǎng)板（CorningCostar公司，美國）；旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀（Synthecon公司，美國）；離心機(jī)（Sigma公司，美國）；酶標(biāo)測定儀（Metertech公司，臺(tái)灣）；C

11、O2培養(yǎng)箱（Heraers Hera cell，德國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；膠原/殼聚糖/磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體由華南理工大學(xué)材料學(xué)院制作提供，直徑5 mm，高5 mm圓柱形，上層以膠原/殼聚糖為主,下層以膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣為主,兩層之間逐漸過度，沒有明顯界限，平均孔徑為100 m,孔隙率90%。    1.2  兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)    1.3  修復(fù)體預(yù)處理    膠原/殼聚糖/-磷酸三鈣層狀梯度修復(fù)體經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒備用，實(shí)驗(yàn)前取12個(gè)置于12孔

12、培養(yǎng)板,DHanks洗3遍,每次20 min,再用DMEM/F12 液浸泡過夜。    1.4  細(xì)胞和支架復(fù)合普通培養(yǎng)    選擇生長狀態(tài)良好的第2、3 代細(xì)胞消化離心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成軟骨細(xì)胞濃度為 1×107/ml,滴入經(jīng)DMEM/F12液預(yù)濕的復(fù)合支架中,每個(gè)支架加入300 l，將培養(yǎng)板放入5%CO2濃度、飽和濕度、37培養(yǎng)箱內(nèi)30 min，然后每孔加入1.0 ml DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔日換液,培養(yǎng)3周， 進(jìn)行相關(guān)檢測。    1

13、.5   細(xì)胞和支架復(fù)合模擬微重力培養(yǎng)    選擇生長狀態(tài)良好的第2、3 代軟骨細(xì)胞消化離心,用含10% 胎牛血清的DMEM/F12液配制成軟骨細(xì)胞濃度為 1×107/ml,滴入經(jīng)DMEM/F12液預(yù)濕的復(fù)合支架中,每個(gè)支架加入300 l，置于孵箱中30 min后將細(xì)胞支架復(fù)合物放入微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀中，加滿DMEM/F12完全培養(yǎng)基，置于5%CO2濃度、飽和濕度、37培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。隔日換液1/3,培養(yǎng)3周,進(jìn)行相關(guān)檢測。    1.5  檢測指標(biāo)    2

14、60; 結(jié)  果    2.1  軟骨細(xì)胞形態(tài)    體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞剛接種時(shí)呈球形,懸浮在培養(yǎng)液中,24 h后開始貼壁,細(xì)胞呈扁平狀,大多數(shù)為三角形，少量多角形,48 h后可見細(xì)胞分裂相,約1周后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶壁,折光度降低,呈“鋪路石”樣（圖1）,可進(jìn)行傳代。第2、3代細(xì)胞S100免疫細(xì)胞化學(xué)染色胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)（圖2）。    2.2  生長曲線    軟骨細(xì)胞和材料復(fù)合后，除第1 d兩組之間無顯著性差異外（P=0.857），其余6個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組之間有顯著性差異（P=0.007,0.002,0.001,0.000,0.000,0.000），微重力組均比培養(yǎng)板組增殖