DNA損傷反應誘導炎癥和衰老通過抑制GATA4自噬

1、TheDNAdamageresponseinducesinflammationandsenescencebyinhibitingautophagyofGATA4DNA損傷反應通過抑制GATA4自噬誘導炎癥和老化introduction:細胞衰老是一個由多重應激導致基因表達變異和擴增的過程。雖然這也是一種潛在的腫瘤抑制機制，但衰老機制也參與了一些病理過程，包括老化，年齡相關的疾病，甚至與致瘤機制有關。衰老細胞能分泌一些衰老相關分泌表型SASP影響自身的微環(huán)境，這些SASP包括前炎性細胞因子，趨化因子，生長因子和蛋白酶。SASP啟動和維持的機制以轉錄因子NF-kB和C/EBPb為特征的經典炎癥調節(jié)

2、機制。rational:P53和p16INK4a/RB是衰老過程的兩個重要核心調控通道。不依賴于p53或p16INK4a的另一種獨立衰老調控通路能調節(jié)SASP。根據miR-146a的啟動子片段開發(fā)了一種綠色熒光蛋白標記的衰老信號，可以檢測到人類成纖維細胞衰老過程中的miR-146a。衰老誘導刺激物能激活SASP,包括復制疲憊，DNA損傷，致癌RAS激活。RESULTS:通過對miR-146a啟動子的分析，我們定位衰老誘導活化的關鍵區(qū)域并確定了轉錄調控因子GATA4在衰老調控中的作用。正常情況下，GATA4與P62自噬體結合發(fā)生選擇性自噬而被降解。在衰老反應中，GATA4和P62反應減弱可以抑制

3、這種自噬反應。GATA4通過誘導能激活NF-kB通路的因子啟動和維持SASP,從而可以促進衰老過程，這些因子包括月中瘤壞死因子受體相關蛋白2和IL-1A。GATA4通路的活化同p53和p16INK4a通路活化機制相似，需要DDR激酶ATM和ATR的活化。不同的是，GATA4通路是不同于p53和p16INK4a的另外的獨立通路。GATA4蛋白大量存在與衰老刺激物誘導的老鼠、正常老化的老鼠及人的多個組織中，包括腦細胞，這些發(fā)現均提示GATA4通路參與年齡相關性炎癥反應的過程。CONCLUSION:我們的結果說明GATA4通過TRAF3IP2和IL-1A激活的NF-kB通路參與自噬反應、DDR所致的

4、衰老及炎癥過程。GATA4通過DDR調控衰老是不同于P53和p16INK4a通路的獨立通路的關鍵。我們認為衰老細胞中大量積聚的GATA4能通過炎癥反應促進老化和疾病，而抑制GATA4通路可能為疾病的治療提供了一個新方向。細胞老化是應激反應的最終階段，由P53和p16INK4a月中瘤抑制蛋白調控。老化的顯著特征是一種與腫瘤生長和老化相關的前炎性反應，SASP。已經證實轉錄因子GATA4可以調控老化和SASP。正常情況下，GATA4能通過P62介導的選擇性自噬作用降解，而衰老反應則可使GATA4保持恒定。Text:在應激狀態(tài)下，細胞老化是一種防止異常細胞進一步擴增的機制。細胞老化抑制細胞和組織的再

5、生能力，衰老細胞的消除有助于誘導老化模型鼠的老化相關表型的表達。而如何接收衰老信號啟動老化反應的具體調節(jié)機制并不清楚。多種衰老刺激信號能引起哺乳動物細胞進入不可逆的生長阻滯期，這些信號包括復發(fā)擴散導致的端粒的縮短、DNA損傷以及活化癌基因的表達。衰老細胞除了能引起細胞生長阻滯外，在基因表達中也有很大的作用，包括SASP的表達。在生理狀態(tài)下，SASP因子可以通過自分泌和旁分泌的方式加強衰老細胞的生長阻滯，老化細胞能刺激癌前細胞或癌變細胞擴增形成月中瘤。另一方面，SASP激活免疫系統(tǒng)可以抑制月中瘤，而當衰老細胞在發(fā)揮作用被移除后可以促進受損組織的修復。SASP可以直接或間接地促進與一些年齡相關性疾

6、病的慢性炎性因子的分泌。盡管SASP由很廣泛的生物學活性，但是對于SASP產生的NF-kB經典途徑以外的作用卻是有限的，比如CCAAT/增強子結合蛋白b(C/EBPb),IL-1a和P38MAPK。在老化刺激下NF-kB炎性反應被激活的機制亦是未知的。與老化生長停滯相比，P53和p16INK4a/Rb月中瘤抑制途徑有重要的作用，SASP并不依賴于P53和p16INK4a/Rb月中瘤抑制途起作用，而是有自己獨立的衰老調控通路。與急劇的正常炎性反應相比，SASP反應很緩慢，到老化細胞生長阻滯通常需要幾天的時間，這將提供一個衰老特異性的激活機制。除了轉錄調控外，自噬通過targetofrapamyc

7、in(TOR)autophagyspatialcouplingcompartment(TASCC影響SASP的形成。TASCC通過mTOR與自噬溶酶體氨基酸殘基結合而起到促進分泌蛋白質合成的作用。也有研究表明抑制自噬在某些條件下能促進老化。因此，自噬和老化之間的關系暫時還不清楚GATA4,anovelsenescenceregulator我們分析了microRNA在非老化細胞和衰老人成纖維細胞的表達，通過復制疲憊誘導老化并發(fā)現miR-146a在老化細胞中高度表達。我們猜測miR-146a調控主要發(fā)生在轉錄水平的初始階段。我們將1.5-kbmiR-146a啟動子片段融合如綠色熒光蛋白中PmiR-

8、146a-GFP。miR-146a在一些老化誘導因子作用下表達增加，包括復制疲憊、電離輻射及致癌基因RAS的表達。通過ECB瀏覽器，我們發(fā)現miR-146a有兩個高度進化的保守域，ECR1和ECRU2。ECR2對基因活性有重要的作用，因為ECR2有NF-kB結合部位，而NF-kB能調控miR-146a,我們從藥理學和遺傳學角度抑制了完全表達SASP的衰老細胞的NF-kB通路。而衰老細胞中只有部分NF-kB被抑制，這個結果表明其它的轉錄因子也作用于激活miR-146a關聯的細胞老化。為了確定其它轉錄因子的活性，我們搜查了那些被預測能結合ECR2的轉錄因子。我們逐一將搜查13個轉錄因子過度表達并檢

9、測miR-146a的活性，只有GATA4符合條件。在衰老細胞中，siRNAGATA4被耗盡。ChIP-qPCR顯示GATA4表達與miR-146aECR2直接連接。GATA4是一種鋅指轉錄因子，在各種器官的發(fā)育中是必不可少的，包括心臟，睪丸，前腸，肝，和腹側胰腺。為了檢測GATA4的功能，我們研究了異位表達或缺乏在人二倍體成纖維細胞老化反應中的影響。GATA4異位表達誘導人包皮成纖維細胞和IMR-90成纖維細胞的老化，通過增加SA-b-Gal的活性及減少BrdU的合成。更重要的是，通過穩(wěn)定表達shRNA導致GATA4耗盡能部分下調IR誘導的SA-B-Gal的活性和延遲復制性衰老。這是由于GAT

10、A4發(fā)生CRISPR突變。這些數據表明GATA4對老化有正性調節(jié)作用。在衰老中GATA4有調控作用，而在肺，結腸癌，前列腺癌，卵巢癌和乳腺癌中，則保持沉默。SelectiveautophagysuppressesGATA4andsenescence在檢測GATA4siRNA的效率時，我們發(fā)現GATA4的量在衰老細胞中增加。事實上，豐富的GATA4蛋白，而不是mRNA,能增加IR-和癌基因誘導的衰老和復制老化。這是由于蛋白質穩(wěn)定性提高，通過放線菌酮和全球蛋白質穩(wěn)定性分析檢測蛋白質的穩(wěn)定性。在真核細胞中有兩個主要蛋白質降解途徑：泛素蛋白酶體和自噬溶酶體途徑。用MG-132抑制蛋白酶體，MG-132

11、是一種蛋白酶體抑制劑，對GATA4沒有影響，而GATA4蛋白在溶酶體抑制劑（溶酶素A、E64d、胃蛋白酶抑制劑）存在的細胞中穩(wěn)定表達。這些發(fā)現提示自噬溶酶體途徑能調控GATA4。自噬部件ATG5或ATG7同樣能上調GATA4蛋白。自噬可以通過特異性自噬受體介導途徑選擇性地降低某些基物。事實上，自噬受體P62的耗盡能增加GATA4蛋白。衰老過程中外源性表達和內源性GATA4與p62相互作用減弱。因此，在正常條件下，GATA4與P62發(fā)生特異性作用發(fā)生自噬，而在老化中，可能與P62的相互作用減弱，GATA4變得穩(wěn)定了。衰老與自噬之間的關系目前還不清楚。自噬在老化或抑制老化過程中是必不可少的。我們結

12、果可以解釋這些矛盾。選擇性自噬可能會通過抑制衰老調控因子如GATA4來防止老化。然而，衰老誘導刺激物可以引起GATA4逃脫選擇性自噬。隨后，非選擇性自噬可能激活有助于老化。因此，GATA4的選擇性自噬可能對老化的起到負性調節(jié)作用。如果是這樣，瞬時抑制自噬可引起衰老。為了驗證這一點，我們利用多西環(huán)素（阿霉素）誘導的shRNA耗盡ATG5或ATG7和瞬時抑制自噬，使GATA4增力口，然后通過去除多西環(huán)素恢復自噬，使細胞達到一個可老化的狀態(tài)。短暫抑制自噬（高濃度GATA4,自噬on）誘導的衰老比持續(xù)性抑制自噬（高濃度GATA4,自噬off）更有效，這種效果，至少在一部分取決于GATA4。連續(xù)和短暫抑

13、制自噬使獲得同樣的GATA4濃度，但連續(xù)抑制未能誘導衰老。在正常狀態(tài)下，P62缺乏比自噬調節(jié)受體ATG7或ATG5的缺乏更有效率的誘導老化。因此，選擇性自噬可以成為GATA4的抗衰老機制，而非選擇性自噬則是促衰老機制。GATA4regulatestheSASP為了確定GATA4調節(jié)老化的機制，我們探究了GATA4是如何影響人成纖維細胞基因表達的。GATA4異位表達時可以誘導老化，我們利用阿霉素誘導GATA4載體在GATA4表達之前和之后對RNA轉錄普進行測序。我們根據基因本體論系統(tǒng)描述了GATA4是如何影響細胞進程的?；虮磉_GATA4的增加對一些應答是有意義的，如免疫應答、炎癥反應、創(chuàng)傷反應

14、，而GATA4的表達減少則與細胞周期的生理過程有關。我們比較了GATA4基因集和與增殖老化基因集的區(qū)別，無論基因是上調還是下調均有意義，而基因的上調更具統(tǒng)計學意義，說明GATA4有轉錄激活因子的作用。結果說明GATA4可能激活一部分老化相關基因。在GATA4調節(jié)的老化相關基因中我們發(fā)現了很多SAPA基因，這些基因能編碼IL6,IL8,CXCL1,粒-巨細胞集落刺激因子（GM-CSF）,細胞外基質蛋白激酶和抑制劑。炎癥應答和免疫應答中的細胞因子和趨化因子由老化細胞分泌，可以改變細胞內微環(huán)境，增強老化阻滯，GATA4通過SASP可能直接調節(jié)其他的老化表型，尤其是生長阻滯。GATA4的異位表達通過R

15、t-qPCR可以誘導SASP相關的基因表達。更為重要的是，在建立老化過程中，GATA4的過度消耗可以抑制很多SASP基因的表達，說明GATA4控制了很多SASP基因而GATA家族的另一成員GATA3并不能增力口SASP相關基因的表達，即使預測說它是一種很強的月中瘤抑制因子。同樣的，GATA3的表達不能增加月中瘤壞死因子相關受體蛋白2TRAF3IP2的表達。GATA4regulatesNF-kBNF-kB在調控SASP上有至關重要的作用，但對于NF-kB是如何激活衰老過程的人們知道得很少。為了檢測GATA4與NF-kB在調節(jié)SASP的關系，我們測試了當NF-kB的重要成分RELA受到抑制時，是如

16、何影響GATA4誘導SASP。RELA耗盡能夠抑制GATA4調節(jié)的SASP相關基因表達。GATA4的表達觸發(fā)NF-kB的激活，而GATA4缺乏在老化過程中抑制NF-KB的活化；這些研究結果表明，GATA4在調節(jié)SASP過程中彳用于NF-kB的上游。為了了解GATA4是如何激活NF-kB的，我們收索了在基因組芯片實驗中發(fā)現的約束GATA4的啟動子，據此發(fā)現并檢驗與激活NF-kB具有同樣功能的基因是如何被GATA4調控的。GATA4減少TRAF3IP2的表達，一種TRAF6的泛素連接酶和TRAF3IP2的缺乏能部分阻滯GATA4激活NF-kB,可以通過SASP基因的表達進行評估。TRAF3IP2異

17、位表達能部分緩解在IR誘導老化細胞中由于GATA4缺乏導致的SASP減少。SASP因子能抵抗TRAF31P2消耗，如IL6和CXCL3,結果表明GATA4的下游基因通過TRAF31P2通路對SASP起到調控作用。RELA消耗能完全阻滯GATA4調控的SASP的活化，除了IL1A外。IL1A在SASP調控中，對NF-KB有正反饋調控作用。因此，SASP在GATA4依賴的途徑中，IL1A可能與TRAF3IP2有協同作用。通過評估SASP基因的表達，IL1A缺乏能減少GATA活化的NF-KB途徑。此外，將SASP相關的活化基因轉移到缺乏GATA4反應的細胞中，由GATA4誘導的細胞通過條件培養(yǎng)液獲得

18、。因止匕，GATA4通過TRAF3IP2andIL1A激活NF-KB途徑作用于SASP°TRAF31P2缺失也部分阻滯GATA4誘導的衰老，SA-B-Gal的活性。不同于GATA4的表達，TRAF31P2表達不足以誘導的SA-B-Gal的活化，卻能激活SASP相關的基因表達。止匕外，TRAF3IP2異位表達與IL1A一起仍然不足以誘導SA-B-Gal活化，卻能激活GATA4。因此，該SASP可能不是GATA4調控衰老的唯一機制。事實上，此前確定的老化調控基因，如早幼粒白血病蛋白（PML）和YPEL3都屬于GATA4誘導的基因。GATA4,anewbranchofthesenescen

19、ceregulatorypathway為了更全面地了解GATA4調控衰老的機制，我們研究了兩個核心衰老的調節(jié)通路中，p53和p16INK4a通路。GATA4對老化的影響是獨立于p53和p16INK4a/Rb途徑的。GATA4激活產生能誘導老化的IR劑量，能保持完整的細胞中缺乏的p53或p53基因和Rb。止匕外，沒有活化的P53和p16INK4a中，GATA4同樣被激活。因此，GATA4是獨立于p53-和p16INK4a的途徑。DNA損傷應答（DDR）作用于該途徑的上游。事實上，抑制DDR調控因子ATM和ATR能抑制老化的GATA4途徑。因此，GATA4途徑誘導的SASP似乎是在DDR的一個獨立

20、分支。DDR是如何抑制自噬基礎上GATA4降解仍然是今后研究的核心問題。GATA4sroleinsenescenceinvivo為了測試GATA4活性和調控作用在體內同樣發(fā)生，我們檢測了存在氧生理條件下小鼠胚胎成纖維細胞通過IR誘導的老化的GATA4表達。Gata4增加能引起衰老誘導的IR增加，需要幾個GATA4靶基因的作用，包括那些編碼Traf3ip2和SASP因子的基因，如IL6,IL1A,和CXCL1因子。因此，GATA4調節(jié)老化表型的途徑也能存在與小鼠中。為了確定GATA4在小鼠體內對老化應答是否有作用，我們檢測了多種組織均老化的輻射鼠的GATA4水平。在皮膚可肝臟中，GATA4增加引

21、起老化誘導的IR增加，因此，GATA4在體內積聚能通過DNA損傷誘導老化。衰老細胞隨著小鼠和人年齡的增長而堆積。我們研究了年輕和老的小鼠（分別是6月齡和22月）并發(fā)現年齡大的小鼠的腎臟和肝臟中GATA4積聚增加：這種積累與p16INK4a基因相關。而且，老化小鼠肝臟表明NF-KB通過RELAX磷酸化被活化，這個結果與我們培養(yǎng)的細胞一致。我們也研究了人腦中的GATA4,老年人的額葉皮質中，GATA4和p16INK4a均增加。為了證實這些結果，我們通過免疫熒光微鏡研究了年輕人和老年人額葉皮質GATA4和p16INK4a基因之間的空間關系。GATA4和p16INK4a在老年人大腦中的表達更多。止匕外

22、，我們在少突膠質細胞、椎體神經元、星形細胞中發(fā)現了GATA4和p16INK4a的一個顯著空間相關性，進一步支持GATA4在人衰老過程中的老化作用。因此，在鼠和人衰老過程中，GATA4可能促進細胞衰老和炎癥反應。我們的研究結果表明，自噬對衰老有正性和負性調節(jié)作用。InresponsetoIR,這些衰老表型依賴于DDR信號激酶ATM和ATR,和衰老相關基因p53和p16INK4a的表達類似。然而，GATA4途徑是方4立于p53和p16INK4a通路的，從而建立了一個新的DDR途徑。GATA4調節(jié)細胞衰老一部分是通過影響SASP起作用的。同樣，GATA4可以作為TRAF3IP2andIL1A介導的N

23、F-kB的上游調節(jié)因子啟動和維持NF-kB活性的調節(jié)因子。GATA4也激活的miR-146a的表達，從而降低NF-KB的活性。GATA4-MIR-146A-NF-kB通路形成了一個無規(guī)律的正反饋途徑，在SASP基因表達風暴形成之后，能抑制炎癥反應。然而，這并不終止炎癥反應，盡管在高水平的miR-146A存在下，衰老細胞也能維持SASP的水平。miR-146a可能防止意外激活該途徑以至于GATA4或其它因子在正常狀態(tài)下隨機波動?？傊覀兊慕Y果表明，GATA4是一衰老表型的關鍵條件因子，并通過IL1A和TRAF3IP2激活NF-kB途徑參與自噬和DDR所致的老化過程。細胞老化被證明是把雙刃劍。這

24、個途徑可以促進正常的發(fā)育和傷口的愈合。然而，衰老細胞的積累可作為識別生物體年齡，能促進老化相關的表型與衰老相關的疾病，包括癌癥和神經退行性變。因此，了解潛在的對老化的控制途徑對人體健康有重要意義。調節(jié)GATA4途徑可能為治療年齡相關性疾病提供了一個新思路。GATA4,anovelsenescenceregulatorInanefforttodevelopnewmarkersforsenescence,weanalyzedmicroRNAexpressioninnonsenescentandsenescenthumanfibroblasts(strainIMR-90fromfetallung).

25、WeinducedsenescencebyreplicativeexhaustionandfoundmiR-146atobehighlyexpressedbysenescentbutnotnonsenescentcells(fig.S1A),aresultalsoreportedforhumanforeskinfibroblasts(HCA2)(34).Givenitsabundantexpression,wesuspectedthatmiR-146aregulationoccursprimarilyattheleveloftranscription.Wethereforegenerateda

26、1.5-kbmiR-146apromoterfragmentfusedtogreenfluorescentprotein(PmiR-146a-GFP).Expressionofthisreporterconstructwassignificantlyincreasedinresponsetoseveralsenescence-inducingstimuli,includingreplicativeexhaustion,ionizingradiation(IR;12Gy),andexpressionofoncogenicRAS(fig.S1B).UsingtheEvolutionarilyCon

27、servedRegionsbrowser(35),wefoundthatthemiR-146apromotercontainstwoevolutionarilyconservedregions,ECR1andECR2.ECR2wascriticalforreporteractivity(fig.S1C).BecauseECR2hasaputativeNF-kBbindingsiteandNF-kBisknowntoregulatemiR-146a(36),weinhibitedNF-kBeitherpharmacologically(withaninhibitorofIkBkinase,Bay

28、11-7082)orgeneticallywithshortinterferingRNAs(siRNAs)targetingtheNF-kBfamilymemberRELA(p65)infullysenescentSASP-expressingcells.NF-kBinhibitiononlypartiallydecreasedreporteractivityinsenescentcells(fig.S1D).Theseresultsindicatethatothertranscriptionfactorsalsocontributetosenescencedependentactivatio

29、nofthemiR-146areporter.Toidentifyadditionaltranscriptionfactorsresponsibleforthereporteractivity,wesearchedforonesthatwerepredictedtobindtoECR2(seeMaterialsandMethods).Weindividuallyoverexpressedeachcandidateandexaminedreporteractivity.Of13transcriptionfactorsselected,onlyGATA4,butnototherGATAfamily

30、members,activatedthereporter(Fig.1Aandfig.S2,AandB).DepletionofGATA4withsiRNAsshowedthatitwasrequiredforreporteractivationduringsenescence(Fig.1B).Chromatinimmunoprecipitationcombinedwithquantitativepolymerasechainreaction(ChIP-qPCR)revealedthatexogenouslyexpressedGATA4bounddirectlythemiR-146aECR2re

31、gion(fig.S2C).TheseresultsindicatethatGATA4contributestoactivationofthemiR-146apromoterinsenescentcells.GATA4isazincfingertranscriptionfactoressentialforthedevelopmentofvariousorgans,includingheart,testis,foregut,liver,andventralpancreas(37).ToexaminewhetherGATA4functionsinsenescence,weexaminedtheef

32、fectsofectopicexpressionordepletionduringthesenescenceresponseofhumandiploidfibroblasts.EctopicexpressionofGATA4inducedsenescenceinhumanforeskinfibroblasts(strainBJ;Fig.1C)andIMR-90fibroblasts(fig.S3,AandB),asshownbyincreasedsenescence-associateb-galactosidase(SA-b-Gal)activityanddecreased5-bromo-2&

33、#39;-deoxyuridine(BrdU)incorporation.Moreimportant,depletionofGATA4withstablyexpressedshorthairpinRNAs(shRNAs)partiallydecreasedIR-inducedSA-b-Galactivity(Fig.1Dandfig.S3C)anddelayedreplicativesenescence(Fig.1E).WeconfirmedtheseresultsbyCRISPRmutationofGATA4(fig.S3D).ThesedataindicatethatGATA4isapos

34、itiveregulatorofsenescence.Consistentwitharegulatoryroleinsenescence,GATA4isfrequentlysilencedinlung,colon,prostate,ovarian,andbreastcancer(38,39).SelectiveautophagysuppressesGATA4andsenescenceWhileexaminingtheefficiencyofGATA4siRNAs(Fig.1B),wenoticedthattheamountofGATA4increasedinsenescentcells.Ind

35、eed,abundanceoftheGATA4protein,butnotmRNA,increasedduringIR-andoncogene-inducedsenescenceandreplicativesenescence(Fig.2A).Thisincreasewasprimarilyduetoincreasedproteinstability,asindicatedbythemeasurementofproteinstabilityinthepresenceofcycloheximide(Fig.2B)andbyglobalproteinstabilityprofiling(40)(f

36、ig.S4A).Twomajorpathwaysineukaryoticcellsmediateproteindegradation:theubiquitin-proteasomeandautophagy-lysosomepathways.InhibitionoftheproteasomebyMG-132,aproteasomeinhibitor,hadnoeffectonGATA4abundance,whereasGATA4proteinwasstabilizedincellstreatedwithdistinctlysosomalinhibitorsknowntoblockautophag

37、y:bafilomycinA1(aselectiveinhibitorofthevacuolar-typeH+-adenosinetriphosphatase)orE64dandpepstatin(lysosomalproteaseinhib-itors)(Fig.2,CandD).Thesefindingsuggesttheautophagy-lysosomepathway,nottheubiquitinproteasomepathway,regulatesGATA4.Consistentwiththisinterpretation,depletionoftheautophagycompon

38、entsATG5orATG7alsoincreasedtheabundanceofGATA4protein(Fig.2E).Autophagycanselectivelydegradecertainsubstrates,mediatedbyspecificautophagicadaptors(4143).Indeed,depletionoftheautophagicadaptorp62increasedtheabundanceofGATA4protein(Fig.2F).ExogenouslyexpressedandendogenousGATA4physicallyinteractedwith

39、p62,andtheinteractionwasreducedduringsenescence(Fig.2Gandfig.S4B).Thus,GATA4appearstobetargetedforautophagicdegradationthroughitsassociationwithp62undernormalconditionsbutbecomesstabilizedduringsenescence,possiblythroughreducedassociationwithp62.Therelationshipbetweensenescenceandautophagyisunclear.

40、Autophagyisreportedtoberequiredfortheestablishmentofsenescence31,32,44)ortoinhibitsenescence(33).Ourresultscanreconciletheseconflictingreports.SelectiveautophagymightpreventsenescencebysuppressingpositivesenescenceregulatorssuchasGATA4.However,senescence-inducingstimulicauseGATA4toescapeselectiveaut

41、ophagy.Subsequently,generalautophagymaybeactivated,whichthencontributestoestablishmentofsenescence.Hence,selectiveautophagyforGATA4maybeanegativesenescenceregulator,whereasgeneralautophagyisapositiveregulatorofsenescence.Ifso,transientlyinhibitingautophagyshouldinducesenescence.Totestthis,weuseddoxy

42、cycline(Dox)-inducibleshRNAstodepleteATG5orATG7andtransientlyinhibitautophagy(45),allowingGATA4toaccumulate,andthenrestoredautophagybyremovingDox,returningthecelltoasenescencepermissivestate.Transientinhibitionofautophagy(GATA4abundancehigh,autophagyon)inducedsenescencemoreeffectivelythandidcontinuo

43、usinhibition(GATA4abundancehigh,autophagyoff);thiseffect,atleastinpart,dependedonGATA4(Fig.2,HandI,andfig.S4C).ContinuousandtransientinhibitionofautophagyincreasedGATA4abundancetosimilarextents,butcontinuousinhibitionfailedtoinducesenescence(Fig.2I).Consistentwiththisfinding,p62depletioninducedsenes

44、cenceevenmoreeffectivelythandiddepletionofthecoreautophagyregulatorsATG7orATG5undernormalconditions(fig.S4D).Thus,selectiveautophagyforGATA4appearstofunctionasanantisenescencemechanism,whereasgeneralautophagyfunctionsasapro-senescencemechanism.GATA4regulatestheSASPToinvestigatethemechanismsthroughwh

45、ichGATA4regulatessenescence,weexploredhowGATA4influencesgeneexpressioninhumanfibroblasts.BecauseGATA4inducessenescencewhenectopicallyexpressed,weperformedtranscriptionalprofilingwithRNAsequencing(RNA-seq)beforeandafterGATA4expressionusingaDoxinducibleGATA4vector.WeusedGeneOntology(GO)analysistosyste

46、maticallycharacterizethecellularprocessesaffectedbyGATA4(46).GenesshowingincreasedexpressioninresponsetoGATA4showedsignificantenrichmentforthetermsimmuneesponse,finflammatoryresponse,ahdresponsewounding,IIwhereasgeneswithdecreasedexpressionweremostlyenrichedforbiologicalprocessesrelatedtothecellcycl

47、e,whichcorrelatedwellwithtermspreviouslylinkedtosenescence(Fig.3AandtableS1).WecomparedtheGATA4-regulatedgeneset(GATA4-regulatedset)withagenesetdifferentiallyregulatedduringreplicativesenescence(Senescerslet).Bothup-regulatedanddown-regulatedgenesoverlappedsignificantly,withgreaterstatisticalsignifi

48、cancefortheup-regulatedgenes(P=2.4610-40),consistentwiththefactthatGATA4actsmostlyasatranscriptionalactivator(Fig.3B).TheseresultssuggestthatGATA4mightactivateamajorportionofsenescence-associatedgenes.AmongtheGATA4-regulated,senescence-associatedgenes,wefoundseveralSASPgenes,includingthoseencodingIL

49、6,IL8,C-X-Cmotifligand1(CXCL1),granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(GM-CSF),andextracellularmatrix(ECM)proteasesandinhibitors(7).Becauseinflammatoryandimmune-modulatorycytokinesandchemokinessecretedbysenescentcellscanreinforcesenescencearrestandalterthemicroenvironment(1,2,10),GATA4mightin

50、directlyregulateothersenescentphenotypes,notablygrowtharrest,throughtheSASP.WeconfirmedthatectopicexpressionofGATA4inducestheexpressionofgenesassociatedwiththeSASPbyreversetranscriptionqPCR(RT-qPCR)(Fig.3C).Moreimportant,depletionofGATA4suppressedtheexpressionofseveralSASPgenesduringtheestablishment

51、ofsenescence(Fig.3D),indicatingthatGATA4indeedcontrolsmanySASPgenes.EctopicexpressionofGATA3anotherGATAfamilymemberpredictedtobeastrongtumorsuppressor(47,48)didnotincreaseexpressionofgenesassociatedwiththeSASP.Likewise,ectopicexpressionofGATA3didnotincreaseexpressionofTRAF3IP2tumornecrosisfactorrece

52、ptorassociatedfactor(TRAF)interactingprotein2,akeyGATA4downstreamtarget(seebelow),althoughhitisfunctionallyactive,asshownbyitsabilitytoactivateitswell-knowntargetIL13(fig.S5A).TheseresultssupportaspecificroleforGATA4inSASPregulation.However,wecannotruleoutthepossibilitythatotherGATAfactorsincludingG

53、ATA3mayhaveasimilarroleinothercelltypes.GATA4regulatesNF-kBNF-kBhasacrucialroleincontrollingtheSASP(18,19,49)(Fig.3D),yetlittleisknownabouthowNF-kBisactivatedduringsenescence.ToexaminetherelationshipbetweenGATA4andNF-kBinregulatingtheSASP,wetestedhowsuppressionoftheessentialNF-kBcomponentRELAaffecte

54、dtheGATA4-inducedSASP.RELAdepletioninhibitedtheexpressionofgenesassociatedwiththeSASPinresponsetoGATA4(Fig.4A).GATA4expressiontriggeredNF-kBactivation,andGATA4depletioninhibitedNF-kBactivationduringsenescence(Fig.4B);thesefindingssuggestthatGATA4actsupstreamofNF-kBinregulatingtheSASP.Tounderstandhow

55、GATA4activatesNF-kB,wesearchedpromotersboundbyGATA4ingenomewideChIPexperiments(50)tofindassociatedgenesthatfunctionasNF-kBactivators,andexaminedtheirregulationbyGATA4.GATA4inducedtheexpressionofTRAF31P2,anE3ubiquitinligaseforTRAF6(51)(Fig.4C),andTRAF3IP2depletionpartiallyblockedGATA4activationofNF-k

56、B,asassessedbytheexpressionofSASPgenes(Fig.4D).Furthermore,ectopicexpressionofTRAF3IP2partiallyrescuedthereducedSASPcausedbyGATA4depletioninIR-inducedsenescentcells(Fig.4E).NotethatcertainSASPfactors,suchasIL6andCXCL3,wereresistanttoTRAF31P2depletion;thisresultsuggeststhatGATA4regulatestheminaTRAF3I

57、P2-independentmanner,eitherdirectlyorindirectlythroughitsotherdownstreamtargets.RELAdepletionalmostcompletelyblockedtheactivationofSASPgenesbyGATA4,withtheexceptionofIL1A(Fig.4A).IL1A,aSASPcomponent,isthoughttoformafeedforwardactivationloopwithNF-kBinSASPregulation(13,52).Thus,IL1Amightcooperatewith

58、TRAF3IP2duringGATA4-dependentproductionoftheSASP.Consistentwiththisidea,depletionofIL1AreducedGATA4activationofNF-kB,asassessedbytheexpressionofSASPgenes(fig.S5B).Furthermore,activationofSASP-associatedgeneswastransmittedtocellslackingGATA4inductionbyconditionedmediumfromGATA4-inducedcells(fig.S5C).

59、Thus,GATA4appearstoact,atleastinpart,throughTRAF3IP2andIL1AtoactivateNF-kBinactivatingtheSASP.TRAF3IP2depletionalsopartiallyblockedGATA4-inducedsenescence,asdeterminedfromSA-b-Galactivity(Fig.4F).UnlikeGATA4expression,however,TRAF3IP2expressionalonewasnotsufficienttoinduceSA-b-Galactivity(fig.S6A),despiteactivatingexpressionofanumberofSASPassociatedgenes(fig.S6C).Moreover,ectopicexpressionofTRAF3IP2togetherwithIL1AwasstillnotsufficienttoinduceSA-b-Galactivity,incontrasttothatofGATA4(fig.S6B).Thus,theSASPmaynotbetheonl