先天性視網(wǎng)膜變性及功能不良性疾病的分子遺傳缺陷研究

1、    先天性視網(wǎng)膜變性及功能不良性疾病的 分子遺傳缺陷研究        分類號：R77412；R7711文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C文章編號：1005-1015(2000)01-0061-031Leber先天性黑(Leber congenital amourosis,LCA)遺傳病因新發(fā)現(xiàn)本病是一組發(fā)病最早、最嚴(yán)重的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病。常因視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷，早期嚴(yán)重變性或功能不良，患者在生后1歲內(nèi)即有盲目。本病在遺傳性視網(wǎng)膜變性中約占5%，主要是AR型遺傳。自從1995年LC

2、A的第1個致病基因定位于17號染色體短臂后，至今已發(fā)現(xiàn)并定位了5個LCA致病基因，包括最近Stockton等(1998)定位到14q24的LCA3的突變基因。其中3個LCA致病基因已被克隆出，并在LCA患者中檢測出突變。這是最近幾年本病的分子遺傳病因?qū)W研究的新發(fā)現(xiàn)。第1個引起LCA的突變基因是視網(wǎng)膜鳥苷酸環(huán)化酶RETGC基因。1996年，Perrault等首次報告在4個LCA家系的先證者中發(fā)現(xiàn)RETGC基因的二種錯義突變及二種移碼突變(frameshift)。認(rèn)為視網(wǎng)膜內(nèi)cGMP合成受損，感光細(xì)胞cGMP控制的離子通道(cGMP-gated cation channel)永久關(guān)閉是LCA發(fā)生的

3、分子遺傳病因。第2個引起LCA的突變基因是CRX。Freund等1998年報告了本病患者中檢測出CRX基因突變。第3個引起LCA突變基因是RPE65。Dryja等1998年報告約16的LCA患者有RPE65基因的突變。因而RPE65發(fā)生突變是導(dǎo)致本病的重要分子遺傳缺陷。2先天性靜止性夜盲(congenital stationary blindness,CSNB)的分子遺傳學(xué)研究新進(jìn)展2.1CSNB基因定位與克隆分離本病為早發(fā)、非進(jìn)行性、主要損害視網(wǎng)膜桿體功能的遺傳性變性類視網(wǎng)膜疾病(inherited degenerative retinopathy)。有AD、AR及XL三種類型，有明顯的遺傳

4、異質(zhì)性。XL型又分為二種亞型，CSNB1為完全型(complete CSNB)，以桿體功能喪失為特征；CSNB2為不完全型(incomplete CSNB)，以桿體功能降低為特征。CSNB1基因已定位于Xp11.4。最近Beck-Hansen等(1998年)報告將CSNB2基因定位于Xp11.23,并對該基因進(jìn)行了克隆分離和鑒定。該基因產(chǎn)物為L型電壓控制的鈣離子通道蛋白-1亞單位(L-type voltage-gated calcium channel,alpha-l-subunit,CACNAlF)。另一個XL型CSNB基因也在1997年(Hardcastle等)定位于Xp11.4(CSNB

5、4),但該基因尚未被克隆。常染色體遺傳CSNB基因定位的研究報告較少。本文作者們曾應(yīng)用連鎖分析療法對1個AD型CSNB大家系進(jìn)行基因定位的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSNB與1號染色體的PGD基因位點間可能存在遺傳連鎖。提示1號染色體可能有AD型CSNB的致病基因。以后Gal等(1994)報告1個丹麥AD型CSNB家系中，CSNB與-L1-iduronidase酶基因位點緊密連鎖，而將AD型的一個致病基因(CSNB3)定位于4p16區(qū)。AD及AR型CSNB的其它致病基因尚需進(jìn)一步作染色體定位研究。2.2CSNB致病基因突變的新發(fā)現(xiàn)：夜盲的分子機制視紫紅質(zhì)基因突變：自從發(fā)現(xiàn)RP患者中視紫紅質(zhì)基因突變后，本文

6、作者們曾采用候選基因方法，應(yīng)用PCR結(jié)合RFLP分析，對1個AD型CSNB大家系的患者檢測了視紫紅質(zhì)基因的部分編碼順序，但在所分析的順序中未發(fā)現(xiàn)有視紫紅質(zhì)基因突變。Rao等隨后(1994年)報告CSNB患者發(fā)生視紫紅質(zhì)基因錯義突變，使第90位氨基酸甘氨酸變?yōu)樘於彼帷２⒄J(rèn)為該突變干擾第296位的賴氨酸與視黃醛生色基團(tuán)的結(jié)合，使視蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)而引起靜止性夜盲。-傳導(dǎo)蛋白基因及-桿體cGMP-PDE基因突變：Dryia等1996年報告了AD型CSNB的一個大家系的患者發(fā)生視網(wǎng)膜桿體傳導(dǎo)蛋白亞單位的基因錯義突變。使該基因成為第3個引起CSNB的突變基因。CSNB的第2個突變基因是桿體cGMP

7、-PDE 亞單位基因，由Gal等1994年發(fā)現(xiàn)在AD型丹麥大家系中發(fā)生雜合錯義突變。該基因突變多發(fā)生于蛋白的N-末端與?-PDE亞單位結(jié)合的區(qū)域，故突變可阻止暗適應(yīng)桿體的PDE完全失活，從而使桿體細(xì)胞脫敏，對低強度光不反應(yīng)而產(chǎn)生夜盲。RPGR基因突變：Hermann等1996年報告對RP及XL型CSNB家系患者進(jìn)行?RPGR基因突變分析的結(jié)果顯示，RPGR基因的突變即可引起XL型RP，也可導(dǎo)致XL型CSNB的發(fā)生。L-型電壓控制的鈣離子通道蛋白-l亞單位(CACNAlF)基因突變：隨著XL型CSNB的致病基因的定位(CSNB2)與克隆，CACNAlF基因便成為研究CSNB分子遺傳缺陷的候選基因

8、。1998年Beck-Hansen等報告在20個不完全型XL CSNB家系患者中，發(fā)現(xiàn)CACNAlF基因6種不同的突變。這些突變導(dǎo)致部分氨基酸的丟失，使感光細(xì)胞電壓控制的L-型鈣離子通道喪失其功能而引起先天性夜盲。2.3Oguchi病的分子遺傳病因和發(fā)病機制本病為AR型遺傳性靜止性夜盲。有特征性眼底灰白色或金輝(golden)色外觀，暗適應(yīng)狀態(tài)時消失，光照后復(fù)現(xiàn)。桿體感光細(xì)胞的暗適應(yīng)過程明顯異常，而錐體的則正常。連鎖分析已將本病基因定位于第2號染色體長臂的視覺傳導(dǎo)阻抑蛋白基因所在的區(qū)域。該阻抑蛋白基因自然就成為Oguchi病分子遺傳病研究的候選基因。Fuchs等1995年報告所檢測的6個Ogu

9、chi病患者中就有5個發(fā)生阻抑蛋白基因第309密碼的純合性1個堿基缺失突變，表明該基因突變是Oguchi病的常見遺傳病因。Maw等1998年也報告了2個印度Oguchi病患者發(fā)生純合性阻抑蛋白基因的突變，引起該蛋白部分C末端氨基酸缺失，喪失阻抑蛋白結(jié)合到磷酸化的視紫紅質(zhì)而熄滅視覺傳導(dǎo)的光激活反應(yīng)的能力，最終導(dǎo)致桿體細(xì)胞脫敏而產(chǎn)生夜盲。Oguchi病發(fā)生夜盲的特征之一是明顯延遲的桿體感光細(xì)胞反應(yīng)恢復(fù)期。視紫紅質(zhì)激酶(rhodopsin kinase,RK)是桿體細(xì)胞特異的酶，催化視紫紅質(zhì)磷酸化而使其失活，與阻抑蛋白協(xié)同作用而熄滅光誘導(dǎo)的感光細(xì)胞內(nèi)信號傳遞。由于RK功能上的重要性，自從其編碼基因被

10、克隆后,RK基因即作為本病的候選致病基因。?Yamamoto等1997年報告了在3個Oguchi病患者中發(fā)現(xiàn)3種RK基因突變。其中2個患者發(fā)生RK基因第5外顯子的純合缺失突變，導(dǎo)致無功能的RK。另一個患者發(fā)生復(fù)合雜合突變，同時攜帶有錯義突變及移碼突變，致RK蛋白C-末端氨基酸喪失。為研究這些RK突變蛋白的致病機制，Khani等1998年在體外培養(yǎng)的COS7細(xì)胞中表達(dá)正常及突變的RK蛋白，并測定和比較其酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的RK對視紫紅質(zhì)的光依賴性磷酸化的催化活性缺乏或顯著降低，為Oguchi病中RK基因突變致病的發(fā)病機制提供了生物化學(xué)證據(jù)。2.4其它夜盲病的遺傳缺陷白點狀視網(wǎng)膜變性為遺傳性非進(jìn)

11、行性變性視網(wǎng)膜疾病，以靜止性夜盲伴眼底點狀黃白色視網(wǎng)膜內(nèi)沉著物為特征。近年已發(fā)現(xiàn)RDS基因突變是部分白點狀視網(wǎng)膜變性的遺傳病因。?Seeliger等1999年報告RPE進(jìn)行性萎縮的一家系二個患者發(fā)生血漿視黃醇結(jié)合蛋白基因的復(fù)合雜合錯義突變?；颊弑憩F(xiàn)為夜盲，有輕度視力下降，進(jìn)行性RPE萎縮及視網(wǎng)膜電異常。生物化學(xué)檢查顯示血中視黃醇水平降低，僅有正常的1/6。血漿視黃醇結(jié)合蛋白缺乏表明RBP基因的突變是引起進(jìn)行性RPE萎縮和夜盲的遺傳缺陷。3遺傳性黃斑變性分子遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究的新進(jìn)展與新概念近年來，遺傳性黃斑變性的分子遺傳與分子生物學(xué)研究進(jìn)展十分迅速，至今已對9個常染色體遺傳黃斑變性的致病基

12、因進(jìn)行了染色體定位，而且其中3個致病基因已進(jìn)行了克隆分離及基因產(chǎn)物鑒定。一些在RP患者中發(fā)現(xiàn)的基因突變也在遺傳性黃斑變性患者中發(fā)現(xiàn)。這種致病基因共享(gene sharing)現(xiàn)象是近年視網(wǎng)膜變性疾病研究所帶來的新概念。3.1Stargardt黃斑營養(yǎng)不良(macular dystrophy)的研究新進(jìn)展：基因突變與臨床表現(xiàn)Stargardt病為最常見的遺傳性青少年發(fā)作性黃斑變性，在遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病中占7。臨床特征為發(fā)病早，612歲即開始視力嚴(yán)重受損，但周邊視覺常不受影響。眼底黃斑區(qū)變性，視網(wǎng)膜下RPE有脂褐質(zhì)樣物質(zhì)積聚。應(yīng)用連鎖分析的方法，近年來已將本病AD型的兩個致病基因分別定位于6q

13、11(STGD3)及13q34(STGD2)。而AR型的一個致病基因則定位于1p13染色體區(qū)(STGD1),由于該染色體區(qū)域含有視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異的ABCR基因，故ABCR基因克隆后即成為研究本病遺傳缺陷的候選基因。1997年，Allikmets等首次報告在AR型Stargardt黃斑營養(yǎng)不良患者中發(fā)現(xiàn)ABCR基因19種不同的突變，提出ABCR基因突變是本病常見的分子遺傳病因。1998年，Nasonkin等也在15個Stargardt黃斑營養(yǎng)不良家系中檢測出ABCR基因的4種致病性突變，其中2種導(dǎo)致無功能性基因產(chǎn)物。同年Gerber等對ABCR基因50個外顯子與內(nèi)含子交界順序進(jìn)行了檢測分析，結(jié)

14、果發(fā)現(xiàn)AR型Stargardt病患者發(fā)生ABCR基因拼接位點突變及另外兩種新的外顯子錯義突變。提示本病有廣泛的等位基因遺傳異質(zhì)性。Roze等1998年對40個Stargardt病家系患者檢測了ABCR基因的全部編碼順序，并進(jìn)行基因型-表型相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)引起ABCR蛋白氨基酸丟失的突變均導(dǎo)致早發(fā)的黃斑變性。Lewis等1998年對150個AR型Stargardt病進(jìn)行ABCR基因突變分析及基因型-表型相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)錯義突變出現(xiàn)在ABCR保守的功能區(qū)域。而發(fā)生在N-末端1/3的錯義突變與本病的早期發(fā)作相關(guān)。兩種最常見的錯義突變(G1961E和A1038V)占所檢測到的ABCR基因突變中的1

15、8.5。對這150個家系的臨床分析還顯示本病患者的第1、2級親屬發(fā)生老年性黃斑變性的頻率比正常人高。因而該作者提出ABCR基因的復(fù)合性雜合(compound heterozygous)突變是引起Stargardt病的重要病因，而一些雜合突變則可能增加對老年性黃斑變性的易感性。3.2Sorsby黃斑營養(yǎng)不良(fundus dystrophy,SFD)分子缺陷與遺傳類型的新概念SFD為常染色體遺傳性黃斑變性疾病，臨床表現(xiàn)與老年性黃斑變性相似。3050歲起開始出現(xiàn)中央視覺損害，可伴有夜盲癥狀。眼底有黃斑區(qū)變性表現(xiàn)，RPE萎縮，異常視網(wǎng)膜下沉著物及Bruch膜廣泛增厚。常因黃斑下新生血管瘢痕或黃斑萎縮

16、而喪失視力。由于本病表現(xiàn)類似于老年性黃斑變性，故為研究老年性黃斑變性復(fù)雜的遺傳病因?qū)W問題提供了有用的遺傳學(xué)模型。1994年Weber等應(yīng)用連鎖分析方法在一個AD型SFD大家系中首次將本病的致病基因定位于22q13，使定位于該染色體區(qū)的金屬蛋白酶-3組抑因子(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP3)基因隨即成為研究本病遺傳病因的候選基因。隨后該作者又報告在2個SFD家系中發(fā)現(xiàn)TIMP3基因點突變。1995年Felbor等報告在一個SFD家系中發(fā)現(xiàn)TIMP3基因的一種新的錯義突變(Ser156Cus)。TIMP3是一種金屬蛋白酶的組織抑制因子，視

17、網(wǎng)膜RPE表達(dá)并分泌TIMP3到細(xì)胞外基質(zhì)(尤其是Bruch膜)中(extrac ellular matrix,ECM)，與ECM的糖蛋白結(jié)合，其N-末端結(jié)構(gòu)區(qū)含有蛋白水解酶活性，從而抑制基質(zhì)中金屬酶的活性。TIMP3在ECM的結(jié)構(gòu)造型中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本病患者中發(fā)現(xiàn)的TIMP3基因突變多在C-末端與金屬蛋白酶的結(jié)合區(qū)域，突變通過破壞蛋白的三級結(jié)構(gòu)，影響其與金屬蛋白酶的結(jié)合或?qū)γ傅囊种谱饔枚餝FD的病理表現(xiàn)。Felbor等1997年對1個原診斷為AR型SFD家系的所有患者進(jìn)行TIMP3基因順序分析，發(fā)現(xiàn)所有患者均攜帶有TIMP3的一種新的雜合突變(Gly166Cys)，而非純合突變。表

18、明該家系的患者為AD型遺傳，而非AR型。同時該作者對其它已報告過的AR型AFD家系進(jìn)行重新分析的結(jié)果，也提示其遺傳方式很可能為AD型?？梢奣IMP3基因突變的研究為本病的AD型遺傳方式提供了分子遺傳學(xué)證據(jù)。從根本上轉(zhuǎn)變了人們對本病遺傳方式的傳統(tǒng)認(rèn)識。3.3Best黃斑營養(yǎng)不良(best macular dystrophy，BMD)致病基因的新發(fā)現(xiàn)BMD又叫蛋黃樣(vitlelliform)黃斑營養(yǎng)不良，為常染色體顯性遺傳性早發(fā)型黃斑變性。臨床特征為早發(fā)黃斑區(qū)內(nèi)融合性黃色團(tuán)塊類似蛋黃。RPE萎縮，其內(nèi)及下面有脂褐質(zhì)沉著。有進(jìn)行性視力下降，但檢眼鏡下的表現(xiàn)常先在出現(xiàn)視覺癥狀前就觀察到。一般認(rèn)為本病

19、的基本缺陷是在RPE。應(yīng)用連鎖分析的方法已將BMD的致病基因定位于11p12區(qū)。近年來，BMD致病基因已被克隆分離和鑒定，其基因產(chǎn)物為視網(wǎng)膜特異性的黃斑營養(yǎng)不良蛋白。該蛋白表達(dá)于RPE，其功能可能涉及到視網(wǎng)膜多不飽和脂肪酸的代謝和運轉(zhuǎn)。Petrukhin等1998年報告該基因在本病患者中發(fā)生5種致病性突變。同年Marquardt等也報告了在BMD12個大家系的12個先證者中，有10個發(fā)生bestrophin基因高度保守的(conserved)氨基酸的錯義突變，而另外兩個先證者發(fā)生缺失突變。這些研究結(jié)果表明，bestrophin基因突變是引起本病的遺傳病因。3.4錐體營養(yǎng)不良(cone dyst

20、rophy,COD)基因缺陷與發(fā)病機制的新認(rèn)識COD為累積視網(wǎng)膜錐體細(xì)胞的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病。表現(xiàn)為進(jìn)行性中央視覺受損，畏光及色覺缺陷，周邊視覺和暗視覺不受影響，以AD型及XL型遺傳多見。XL型的第1個致病基因定位于X染色體短臂Xp11-4(COD1)。1997年Bergen等應(yīng)用連鎖分析將XL型COD的第2個致病基因定位到X染色體長臂Xq28區(qū)。AD型COD的第1個致病基因于1995年定位于17p13。最近用染色體缺失定位方法將AD型COD的另一個致病基因定位于6q25。Payne等1997年報告6號染色體6p21.2區(qū)還有一個AD型COD的致病基因(COD3)，并隨后對其進(jìn)行了分離鑒定。

21、其基因產(chǎn)物為鳥苷酸環(huán)化酶激活蛋白1(guanylate cyclase activating protein1,GCSP1)。GCAP1具有激活錐體感光細(xì)胞的鳥苷酸環(huán)化酶的功能，從而促進(jìn)感光細(xì)胞內(nèi)cGMP的生物合成。Payne等1998年發(fā)現(xiàn)1個AD型COD家系的所有患者出現(xiàn)GCAP1基因第99密碼的單個堿基錯義突變。GCAP1是表達(dá)于感光細(xì)胞外段的鈣離子結(jié)合蛋白，突變后可能阻礙其與鈣離子結(jié)合，從而干擾其激活鳥苷酸環(huán)化酶的功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP降低。Sokal等1998年對該突變蛋白的體外研究，發(fā)現(xiàn)突變的GCAP1蛋白對鈣離子的敏感性發(fā)生了明顯的改變，引起生理性暗適應(yīng)條件下低量但持續(xù)刺激鳥苷

22、酸環(huán)化酶，使錐體細(xì)胞內(nèi)生理水平的cGMP改變而引起錐體細(xì)胞變性。3.5其它遺傳性黃斑變性的分子遺傳學(xué)研究Keen等1994年報告視網(wǎng)膜形營養(yǎng)不良(retinal pattern dystrophy)的患者發(fā)生RDS基因第140號密碼4個堿基的插入突變是其遺傳病因。Felbor等1997年在20個成年型蛋黃樣黃斑營養(yǎng)不良患者中檢測出RDS基因5種不同的突變，據(jù)估計，約有18的本病患者攜帶有RDS基因點突變。不同種類的突變是造成臨床表現(xiàn)變異的原因。Rozet等1998年對15個AR型晚發(fā)黃色斑點狀黃斑變性(late-onset fundus flavimaculatus,FFM)家系的患者篩選了A

23、BCR基因的全部編碼順序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者發(fā)生影響ABCR蛋白中性氨基酸的錯義突變。表明ABCR基因的突變是引起本病發(fā)生的病因。4老年性黃斑變性遺傳病因研究的重大突破老年性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是有多種病理生理機制的一組異質(zhì)性黃斑變性疾病。是西方國家55歲以上者最常見的致盲眼病。一直認(rèn)為其基本病理缺陷是視網(wǎng)膜RPE功能不良，發(fā)病涉及到遺傳和環(huán)境致病因素。流行病學(xué)研究顯示吸煙可升高AMD的發(fā)病風(fēng)險。營養(yǎng)學(xué)研究提示一些AMD的發(fā)生可能與微量元素Zn及Se等以及維生素不足有關(guān)。臨床上，AMD分為兩種類型。干性AMD占約80，特征性表現(xiàn)為包括RPE內(nèi)或其下細(xì)胞碎屑，RPE色素不規(guī)則或RPE萎縮；濕性AMD特征性表現(xiàn)有漿液性RPE脫離及脈絡(luò)膜黃斑下新生血管形成。該型發(fā)病占20。AMD中遺傳致病因素的作用早在九十年代初就已引起了眼科和遺傳學(xué)家的關(guān)注。1994年Heiba等報告對年齡相關(guān)黃斑病變(age-related maculopathy)進(jìn)行遺傳學(xué)上的同胞相關(guān)及分離分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)遺傳因素，尤其是單個主基因是本病發(fā)生的重要病因。1997年DeLaPaz等對有3個以上年齡相關(guān)黃斑病變患者的家系(即隱性遺傳型AMD)進(jìn)行臨床遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)本病有遺傳相關(guān)的表型異質(zhì)性(phenotypic heterogeneity)。然而