BCA蛋白濃度測定試劑盒完整版

1、BCA蛋白濃度測定試劑盒 說明23225蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為500試管或5000微孔板的檢測供應充分的試劑23227蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為250試管或2500微孔板的檢測供應充分的試劑試劑盒組分：BCA 試劑A，1000 mL (No. 23225產(chǎn)品中) 或 500mL ( No. 23227產(chǎn)品中)，碳酸鈉，碳酸氫鈉，二喹啉甲酸，酒石酸鈉溶于0.1 M氫氧化鈉中。 BCA 試劑B , 25 mL, 包括4%硫酸銅一次性標準白蛋白, 2mg/ mL, 10 × 1 mL 安瓿, 包含2 mg/ mL牛血清白蛋白(BSA) 存在于0.9% 鹽和0.05%疊氮化鈉 中。儲存：以

2、上試劑保持在室溫下儲存和裝運留意：假如試劑 A 或 試劑 B 在低溫下運輸或長期儲存時消滅沉淀現(xiàn)象，可以通過緩慢加溫或輕輕攪拌溶液使沉淀物溶解。當試劑變色或確定微生物污染時請丟球試劑盒。名目介紹.1預備標準試劑和工作試劑.2預備試管.3預備微型版.3故障檢修.4有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品.5附加信息.5參考文獻.6介紹美國熱電（Thermo）公司的BCA蛋白濃度測定試劑盒 是基于二喹啉甲酸(BCA)通過比色檢測和定量測定總蛋白的洗滌劑兼容配方。該方法通過堿性介質(zhì)中的一種蛋白結(jié)合了Cu2使其顯著削減轉(zhuǎn)變?yōu)?Cu1 （縮二脲反應）。用一種含二奎琳甲酸的試劑選擇性的比色法高敏感的比色杯中的Cu1

3、. 這種測定方法的紫色色反應產(chǎn)物是通過BCA的兩個分子和亞銅離子螯合作用形成的。這種水溶性復合物在562nm 處有強吸取峰。在大的活性范圍內(nèi) (20-2000µg / mL）幾乎同蛋白濃度增加呈線性關(guān)系。BCA 法不是真正的終點的方法 ；也就是說，最終顏色連續(xù)進展。孵化之后, 連續(xù)的顏色進展速度是足夠慢以允許一起進行測定大量樣本。大分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),肽鍵的數(shù)量和存在的四個特定氨基酸(半胱氨酸,胱氨酸，色氨酸和酪氨酸)據(jù)說是與BCA形成顏色產(chǎn)物的緣由。因此,蛋白濃度的測量通常要參照標準的一個常見的蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白。一系列已知濃度的蛋白質(zhì)稀釋液是為與之相近的未知蛋白質(zhì)濃度測定預備的。

4、由于每一個未知濃度的測定都需要基于標準曲線。假如需要將一個未知蛋白精確定量，選擇一個與未知蛋白特性相像的標準蛋白是可取的。例如，當測定免疫球蛋白時牛血清丙種球蛋白可以被當做標準蛋白。以下給出了兩種檢測過程： 其中,試管程序需要一個較大的體積(0.1毫升)的蛋白質(zhì)樣品。然而,由于它使用了一個樣品比例為1:20的工作試劑(v / v),所以將干擾物質(zhì)的影響降到最小。在酶處理程序供應了一樣品處理酶，需要體積較小(10 -25µL)的蛋白質(zhì)樣品。然而,由于使用了樣品比例為1:8的工作試劑(v / v)，所以在克服干擾物質(zhì)濃度時機敏性降低，從而獲得的檢測水平較低。標準試劑和工作試劑的預備（試驗

5、程序需要的兩個）A預備稀釋的BSA標準液表1為導向,預備一套蛋白質(zhì)標準。稀釋標準的內(nèi)容為,將一個盛在安瓿管中的標準BSA稀釋到幾個潔凈的瓶子中,最好使用和樣本(s)相同量的稀釋劑。依據(jù)表1的建議：每1毫升的 安瓿管中加入2毫克/毫升的BSA標準液對于預備一系列的標準稀釋液是足夠的。每個稀釋標準重復三次也是足夠量的。表一：預備稀釋的BSA標準液標準試管協(xié)議和微型版程序的稀釋方案（活性范圍=20-2000µg/mL）管號稀釋液體積（µL）BSA來源及體積（µL）BSA終濃度（µL/mL）A0300的原液2000B125375的原液1500C325325的原液

6、1000D175175的B管稀釋液750E325325的C管稀釋液500F325325的E管稀釋液250G325325的F管稀釋液125H400100的G管稀釋液25I40000=空白加強試管協(xié)議的稀釋方案（活性范圍=5-250µg/mL）管號稀釋液體積（µL）BSA來源及體積（µL）BSA終濃度（µL/mL）A700100的原液250B400400的A管稀釋液125C450300的B管稀釋液50D400400的C管稀釋液25E400100的D管稀釋液5F40000=空白B：預備BCA的工作試劑（WR）1.總共需要的WR的體積可以通過以下公式計算出來：（

7、標準液+未知液）×（平行數(shù)目）×（每個樣品中加入的WR體積）= 總共所需的WR體積例如：標準的試管程序有三個未知液，每個樣品做兩組重復：（標準液9mL+未知液3 mL）×（平行數(shù)目2）×（2 mL）=總共所需的WR體積48mL留意：試管程序中每個樣品管加2.0ml WR 微型版程序中每個樣品中只需要加200ul WR2、WR的制備：（BCA 試劑A:B=50:1），對上述樣品,將50mL試劑A與1mL試劑B混合。留意：當試劑B加入到試劑A的開頭，濁度觀看表明：混合后快速消逝變成澄清的綠色的。預備充分的WR是基于所測樣品數(shù)量上的。假如將WR儲存在處于室溫（

8、RT）的密閉容器中，那么幾天之內(nèi)WR是穩(wěn)定的。簡要步驟（試管程序，標準方案）混合WR（50A+1B）充分混合（0.1mL樣品+WR）溫育：37,30min.然后冷卻分光光度計562nm讀吸光度試管程序（樣品：WR =1:20）1、用移液管移取每個標準品和所測樣品的重復0.1ml到有標簽的對應試管中。2、在每個管中加2.0ml的WR，混勻。3、封口，然后溫育試管（選擇時間和溫度）1）標準方案：37 30min(working range=20-2000ug/ml)2）RT方案：RT 2h(working range=20-2000ug/ml)3）Enhanced Protocol(加強方案)：6

9、0 30min(working range=5-250ug/ml)留意：每個試驗中都增加培育時間和溫度，增加的凈吸光度，降低試劑的最低檢測水平和方案的工作范圍；使用水浴加熱管要么是標準(37°C培育)或是增加(60°C 培育)協(xié)議。使用強制的培育可能會由于熱傳遞不均勻使其在顏色變化上引進明顯的誤差。4、使全部管子冷卻至室溫5、分光光度計設(shè)定在562nm，當比色皿中裝的是水時給儀器校零。隨后，確保在10min內(nèi)測完全部樣品的吸光度。留意：由于BCA測定不是真正的終點，即使冷卻到室溫顏色還會連續(xù)變化。然而，由于在室溫下顏色變化速度比較慢，所以假如在10min內(nèi)測完全部試管的吸光

10、度就不會引進明顯的誤差。6、 全部的單個標準品與所測的樣品重復在562nm測得的吸光度都要減去在562nm測得的全部空白標準品的吸光度平均值。微型板程序（樣品：WR =1:8） 1、用移液管移取25ul的WR到每一個標準品與未知樣品所在的微型板中（working range=20-2000ug/ml）留意：假如樣品大小被限制為：每個未知樣品和標準品只能使用10ul（sample toWR ratio=1:20）.然而，被測量的working range在這種狀況下將被限制為125-2000ug/ml。2、每個孔中加200ul的WR，用plate shaker混30s，使其徹底混勻3、封口，溫育

11、 37 30min 4、 冷卻到室溫5、用酶標儀測量在562nm或接近562nm的讀數(shù)留意：1）這種方法中波長在540-590nm的范圍內(nèi)都能被成功的測量 2）由于讀板器使用的光線長度比分光光度計的比色皿要短，所以微型板程序需要使用樣品比例比較大的工作試劑去獲得與標準試管程序相同的靈敏度。假如需要高于562nm的測量，要將培育時間增加到2h. 3）增加培育時間或樣品工作試劑的體積比率，增加每個well在562nm的凈測量值，降低實際的最低測量水平和測量的working range。只要每個標準樣與未知樣都被同等對待，這樣的修改也是有益的。6、全部的單個標準品與所測的樣品重復在562nm測得的吸

12、光度都要減去在562nm測得的全部空白標準品的吸光度平均值。7、預備一個標準曲線通過繪制每一個標準BSA在562nm測量的相對于空白對比的吸光度平均值。它ug/ml的濃度。使用標曲去測量每一個未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。留意：假如聯(lián)系微型板讀數(shù)器使用擬合的曲線算法，一個有四個參數(shù)的或最合適的曲線將供應比純線性狀態(tài)更精確的結(jié)果。假如用手繪制這個結(jié)果，一個點-分曲線將比線性更加適合標準點。故障檢修問題可能緣由 解決方案在任何管中都無顏色樣品包含銅螯合劑透析，脫鹽，或稀釋樣品。增加工作試劑中銅濃度(例如,使用,試劑A:B 50:2) 使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)空白吸取是可以的,但是標準和樣本比

13、預期的顯示更少顏色強酸性或堿性緩沖液轉(zhuǎn)變了工作試劑的pH透析，脫鹽，或稀釋樣品。顏色在錯誤波長下被測量確定在562nm波長下測吸光度樣品的顏色比預期的深蛋白濃度太高稀釋樣品樣品包含脂質(zhì)或脂蛋白添加以削減脂質(zhì)干擾使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)全部試管(包括空白)都是暗紫色緩沖液中含有還原劑透析或稀釋樣品。使用的產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)緩沖液中含有巰基緩沖含有生物胺（兒茶酚胺）需要在不同波長下測量顏色分光光度計或酶標儀沒有562nm濾光器從540nm到590nm顏色可以在任何波長下被測量,雖然標準曲線的斜率和整體測量的靈敏度將削減A：干擾物質(zhì)某些物質(zhì)干擾BCA檢測是已知的，包括潛在

14、的還原劑，螯合劑，強酸或強堿。由于他們可以干擾估算蛋白質(zhì)每分鐘濃度, 作為樣品緩沖液的組份應避開下列物質(zhì)：抗壞血酸 EGTA 鐵 不純的蔗糖兒茶酚胺 不純的甘油 脂質(zhì) 色氨酸肌酸酐 過氧化氫 蜜二糖 酪氨酸半胱氨酸 酰肼類 苯酚磺酞 尿酸其他物質(zhì)對BCA法檢測蛋白量有較少程度的干擾。并且這些在原來的樣本中低于肯定濃度只有很小的影響（可以容忍）。很多物質(zhì)的最大兼容的濃度在標準測試管協(xié)議中被列出。表 2 （見說明的最終一頁）。物質(zhì)是兼容與標準測試管協(xié)議中指定的濃度，假如蛋白濃度的估量的誤差是由物質(zhì)的存在所造成將會小于或等于 10 。在每一個試驗之前，這些物質(zhì)都會用現(xiàn)配的WR進行測試?？瞻仔Ｕ脑?

15、62nm的吸光度測量值（1000µg / mL白蛋白標準品+物質(zhì)）將會同0.9%生理鹽水中精確配制的標準品在562nm出的凈吸光度進行比較。樣品：WR為1： 8 (v/v)的微孔板過程中最大兼容濃度將比較低。 B .消退或削減干擾物質(zhì)影響的,策略BCA蛋白含量測定中干擾物的影響可以用以下幾個方法消退或克服。l 通過透析或凝膠過濾去除干擾物質(zhì)。l 稀釋樣品,直到不再有干擾。這種策略只在起始蛋白質(zhì)濃度足夠多余稀釋后仍在檢測活性范圍之內(nèi)是有效的。l 用丙酮酸或三氯乙酸(TC A) 沉淀樣品中蛋白質(zhì)。液體包含干擾物質(zhì)將被丟棄，蛋白沉淀很簡潔在超純水中溶解或直接用堿性BCA WR溶解。這一方案

16、的具體流程可從我們網(wǎng)站獲得。另外, 23215號產(chǎn)品將被使用 (見相關(guān)Pierce產(chǎn)品)。l 適當?shù)脑黾覹R中銅的量 (預備WR試劑A:B為 50:2 或50:3、),這將削減銅螯合劑的干擾留意:為了最大限度的精確度,蛋白質(zhì)標準品必需和樣品(s)同樣處理。有關(guān)美國熱電其他產(chǎn)品15041 96孔板100/pkg15075 試劑水庫200/pkg. 15036 96孔板密封帶100/pkg. 23209 標準白蛋白安瓿2mg/ mL 10×1毫升安瓿,包含牛血清白蛋白23208 預稀釋的蛋白質(zhì)檢測標準品：牛血清白蛋白集合，7 × 3.5mL23212 牛伽瑪球蛋白標準品2 mg

17、/mL, 10 × 1 mL安瓿23235 微型BCA蛋白檢測試劑盒工作范圍為0.5-20µg / mL23236 考馬斯亮藍檢測試劑盒，工作范圍的1 - 1500µg /mL23215 Compat- Able 蛋白檢測試劑組23250 BCA蛋白檢測試劑盒-兼容還原劑附加信息A請訪問我們的網(wǎng)站了解更多的信息,包括下列事項:常見問答技術(shù)指導：消退樣品中干擾物質(zhì)對蛋白質(zhì)檢測的影響B(tài) .替代總蛋白檢測試劑假如不能克服樣品中還原物或金屬螯合物的干擾。由一個削減物質(zhì)或metal-chelating物質(zhì)包含在,試試美國熱電公司的23236號 考馬斯亮藍檢測試劑盒，它對這些物質(zhì)較不敏感。C. 玻璃器皿的清潔和重利用當心謹慎使用玻璃器皿。全部的玻璃器皿必需清洗和最終的超純水沖洗。D、不同的蛋白質(zhì)的反應特征常用的總蛋白含量測定方法某種程度上顯示了不同蛋白的不同反應。這些差異