低氧預適應對小鼠海馬組織FasL表達的影響

1、低氧預適應對小鼠海馬組織Fas-L表達的影響 作者：姜樹原 高麗君 張勝 周立社 邵國【摘要】 目的:觀察重復性低氧對小鼠海馬組織內Fas-L蛋白質表達的影響。方法:小鼠低氧0 次(H0)、1 次(H1)、4 次(H4)后取海馬組織,應用 Western Blot 技術,檢測小鼠海馬組織內Fas-L的蛋白表達變化。結果:實驗發(fā)現H0、H1和H4組海馬組織內Fas-L有表達，H4組與H0組之間沒有差異，H1組顯著升高（P<0.05，與H0和H1比較）。結論:急性低氧預適應使小鼠海馬組織Fas-L表達改變。 【關鍵詞】 低氧預適應;海馬;Fas-L Abstract Objectiv

2、e：To detect the effect of hypoxia preconditioning on Fas-L expression in acute repeated hypoxic mice hippocampus. Methods：Mice were divided into 3 groups randomly and were exposed to hypoxia for 4 runs (H4 group)，1 run (H1 group) and 0 run (control group),respectively. Western was used to examine th

3、e Fas-L level in mice hippocampus after exposure to hypoxia, with total protein extracted from mice hippocampus for Western blot. Results： Fas-L was found in H0, H1 and H4 group. Fas-L protein levels were found to be increased in H1 (P<0.05, vs.H4 and H0). There is no difference between H4 an

4、d H0. Conclusion： The change of Fas-L protein level is closely related to protection of the brain and the formation of preconditioning in hypoxic preconditioned mice. Key words Hypoxic preconditioning ; Hippocampus ;Fas-L 低氧/缺血是造成腦組織損傷的最常見的臨床因素，嚴重影響人類的健康。腦雖然對低氧/缺血極為敏感，但神經細胞對低氧/缺血有一定的耐受性。1990年Kitagaw

5、a等1發(fā)現腦組織存在低氧/缺血預適應現象，即腦經預先亞致死性的低氧/缺血暴露，可以增強腦對隨后致死性低氧/缺血的耐受力。到目前為止其具體機制尚不十分清楚，但腦保護效果卻很肯定。 呂國蔚教授上世紀60年代發(fā)現小鼠經間斷急性重復密閉低氧處理后，對低氧的耐受性隨低氧的次數的增加而遞增2。急性重復密閉低氧引起腦內眾多物質發(fā)生變化，其中具有腦保護作用的一些物質發(fā)生上調，而具有腦損傷作用的物質發(fā)生下調3。Fas-L是調節(jié)細胞凋亡的重要分子，有“死亡分子”之稱，但其在急性重復低氧預適應中的作用尚無報道。本工作研究Fas-L表達在急性重復低氧小鼠海馬中的變化，探討急性重復低氧預適應形成腦保護過程中神經細胞凋亡

6、的情況。1 材料與方法1.1 動物模型復制Bal b/c近交系雄性小鼠，68周齡，體重1822g，屬清潔級動物，由軍事醫(yī)學科學院提供。按以前報道復制模型3, 即將小鼠置于含有新鮮空氣、經過標定的150mL 廣口瓶內,以橡皮塞密閉,記時。動物一旦出現喘呼吸（低氧耐受極限標志）,立即取出,轉移到另一相同體積、含有新鮮空氣的廣口瓶內,密閉,記錄低氧耐受時間,依此類推共進行4次低氧實驗。實驗分H0、H1、H4三組，H0為正常對照組，H1為低氧1次組，H4為重復低氧4次組。隨后立即斷頭取腦，剝離海馬。1.2 Western Blot將海馬置凍存管液氮凍存,然后移入裂解液中，用超聲粉碎儀勻漿，用BCA法進

7、行總蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，配制樣品，100加熱10min變性。從上述各組樣品中分別取75g的總蛋白上樣，用8%SDS-PAGE、4、20mA電泳，當指示劑溴酚藍電泳到分離膠時調節(jié)電流為30mA繼續(xù)電泳3.5h；隨后立即于4、400mA條件下通過濕轉法將蛋白從SDS-PAGE膠上轉移到硝酸纖維素（NC）膜上，轉膜5h；將NC膜用TBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl )振搖漂洗10min，10%脫脂牛奶封閉1h，再用TTBS(10mmol/L Tris-Cl, pH7.5, 250mmol/L NaCl, 0.25% Tween-

8、20)振搖洗膜3次，每次10min；NC膜與用TTBS稀釋的Fas-L多克隆抗體（1500）或actin單克隆抗體（1400）常溫下孵育4h，用TTBS洗膜，方法同上，再與用TTBS稀釋的二抗孵育1h, TTBS洗膜，方法同上；ECL試劑11混合與膜反應均勻，約5min。在暗室中與X光片曝光520min，再將膠片置于顯影液和定影液各2min后觀察。1.3 統(tǒng)計學處理結果以x±s 表示, 用SPSS10.0 數據統(tǒng)計軟件ANOVA 和Tukey 對組間數據進行處理和分析,以P<0.05 為檢驗水準。2 結果2.1 不同低氧次數對小鼠耐受時間的影響見圖1，由圖可見隨低氧次數

9、的增加小鼠的低氧耐受性增強。2.2 Western blot結果表明，Fas-L在 H0、H1和H4組中均有表達，以-actin為內參，計算各組蛋白質的相對豐度值。H0、H1和H4組Fas-L的相對豐度分別為0.86±0.10、1.13±0.21、0.91±0.16（n=5）。Fas-L蛋白在低氧后增加，低氧預適應后又向基礎水平回落，見圖2、圖3。3 討論 低氧/缺血可以影響神經細胞的正常生理功能，嚴重時會造成神經細胞的死亡。低氧/缺血條件下在非神經細胞中表達的死亡誘導配體（death-inducing ligands，DILs）都涉及到細胞凋亡過程，DILs包括

10、Fas-L (APO-1L/ CD95-L)、腫瘤壞死因子(TNF)相關凋亡誘導配體(TRAIL/APO-2L)以及腫瘤壞死因子-（TNF-）等4。Martin-Villalba等5研究顯示成年大鼠腦缺血后Fas-L表達使神經細胞凋亡，抑制其表達則可以有助于細胞的生存。Fas是細胞表面的蛋白受體分子，是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，Fas-L是TNF家族型膜蛋白，Fas與Fas-L相互作用，將凋亡信號引入細胞內，激活caspase信號系統(tǒng)，引起細胞凋亡。 小鼠通過急性重復低氧可以在短時間內獲得預適應，其低氧耐受時間隨低氧次數的增加而增加。在重復低氧過程中，腦中一些化學物質的活性或含量以及氣體

11、/能量代謝都發(fā)生了變化6-7，進而維持細胞生存。在此過程中，腦損傷物質如興奮性氨基酸（谷氨酸等）下調3。而Fas-L是已經明確參與神經細胞凋亡的分子，如其表達下調，對于神經細胞生存有重要作用。 本研究發(fā)現三組小鼠海馬組織中都檢測到Fas-L，本實驗觀察到H1組小鼠海馬組織內Fas-L水平較H0組和H4組顯著增加，而H4組又向基礎水平回落。有文獻報道正常條件下大腦中檢測不到Fas-L5，與本研究中H0中可以檢測到Fas-L結果不同,而Minogue等8研究結果則與本報道相同，即常氧條件可以檢測到Fas-L。大量研究顯示，低氧/缺血可以增加Fas-L表達，與本實驗H1組結果相一致。而低氧預適應組海

12、馬組織中Fas-L沒有因為低氧次數增加而增加，相反其蛋白量與H0組之間沒有顯著差異。我們先前研究大腦皮層細胞線粒體超微結構發(fā)現，H1組使線粒體發(fā)生腫脹，而H4組使線粒體的結構又得到恢復9。因此由Fas-L和線粒體亞顯微結構變化可知，低氧預適應形成的腦保護抑制神經細胞凋亡，Fas-L降低可能是預適應形成并參與腦保護的重要環(huán)節(jié)。 低氧/缺血預適應是個復雜的細胞和組織過程，具有保護作用的分子如VEGF的上調及具有損傷作用的物質如Fas-L下調對生物個體的生存是至關重要的10。低氧/缺血細胞應急應答中涉及c-Jun N末端激酶/應急激活蛋白激酶（stress-activated proteinkina

13、ses ，JNK/SAPKs)活化。隨后JNK/SAPKs轉位進入核內通過磷酸化激活c-Jun轉錄因子，進而誘導c-Jun/AP-1靶基因表達，Fas-L即為其靶基因之一。本研究只探討了低氧預適應對Fas-L的影響，要進一步明確Fas-L的變化原因，需對JNK/SAPKs信號通路做深入研究，通過揭示低氧預適應可能機制將對高原醫(yī)學、運動醫(yī)學和航天醫(yī)學做出貢獻。【參考文獻】 1Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al.“Ischemic tolerance” phenomenon found in the brainJ. Brain Research, 19

14、90, 528：21-24.2潘世崴.低氧適應的組織機制/病理生理科學進展(一)M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1963：169-273.3Lu GW, Yu S, Li RH, et al. Hypoxic preconditioning: a novel intrinsic cytoprotective strategyJ. Mol Neurobiol, 2005, 31(1-3): 255-271.4Nagata S. Apoptosis by death factorJ. Cell, 1997, 88: 355-365. 5Martin-Villalba A,Hell L,Jeremias

15、L, et al. CD95 ligand(Fas-L/APO-1L) and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand mediate ischemia-induced apoptosis in neuronsJ. J Neurosci, 1999, 19 (10): 3809-3017.6Lu GW, Liu HY. Downregulation of nitric oxide in the brain of mice during their hypoxic preconditioningJ. J Appl Physi

16、ol, 2001,91:1193-1198.7Lu GW, Cui XY, Zhao BM. Alteration of oxygen consumption and energy metabolism during repetitive exposure of mice to hypoxiaJ. Neurochem Res,1999，24: 625-628.8Minogue AM, Schmid AW, Fogarty MP, et al. Activation of the c-Jun N-terminal Kinase Signaling Cascade Mediates the Effect of Amyloid-on Long Term Potentiation and Cell Death in HippocampusJ. JBC,2