CGRP和NGF對全腦缺血再灌注大鼠腦組織PKB表達的調(diào)節(jié)作用

1、CGRP和NGF對全腦缺血再灌注大鼠腦組織PKB表達的調(diào)節(jié)作用         08-10-16 15:26:00     作者：邢雪松，呂威力，臧晉    編輯：studa20【摘要】  研究大鼠腦缺血再灌注后蛋白激酶B（protein kinaseB, PKB）的表達，探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和神經(jīng)生長因子（NGF）對腦組織缺血再灌注的保護作用及機制。方法：根據(jù)Nagasawa線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞(MC

2、AO)模型,采用電鏡、免疫組織化學SABC法及顯微圖像分析檢測海馬及皮質(zhì)內(nèi)PKB的表達。結(jié)果：大鼠缺血再灌注海馬及頂葉皮質(zhì)內(nèi)PKB反應(yīng)產(chǎn)物較正常組增多(P<0.05),而注射CGRP或NGF后陽性產(chǎn)物明顯高于缺血再灌注組(P<0.01),二者聯(lián)合應(yīng)用效果更加顯著(P<0.05)。結(jié)論：CGRP及NGF參與缺血神經(jīng)元PKB的調(diào)節(jié),二者對缺血神經(jīng)元有協(xié)同修復作用。 【關(guān)鍵詞】  蛋白激酶 神經(jīng)生長因子：To investigate the expression of protein kinase B(PKB) in hippocampusafter regional c

3、erebral ischemia and reperfusion in rats, explore the protective effects and mechanism of calcitonin and generelated peptide(CGRP) and nerve growth factor(NGF) on brain tissue.Methods：An novel model of regional cerebral ischemia and reperfusion induced by middle cerebral artery occluded (MCAO)in rat

4、s was modeThe expression of PKB in hippocampus and cortex was detected with electron microscope,SABC immunohistochemical method and analyzed by microimage system. Results：The expression of PKB in hippocampus and cortex was increased after cerebral ischemia and reperfusion(P<0.05)ompared with this

5、, the percentage of PKB immunoreaction positive cells in CGRP or NGF group were higher (P<0.01)The combined usage of CGRP and NGF enhanced such effects(P<0.05).Conclusion：The results indicate that CGRP and NGF participate in the regulation of expression of PKB in ischemic neurons,and they may

6、cooperate with each other.calcitonin generelated peptide; nerve growth factor; protein kinase B; hippocampus; neuron ischemia    腦缺血導致神經(jīng)元壞死變性、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和（或）凋亡，其機制十分復雜，至今尚不完全清楚。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide, CGRP）是于1982年第一個利用基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的活性多肽，由37個氨基酸組成，廣泛存在于神經(jīng)組織，具有改善腦血流及神經(jīng)保護作用1。神經(jīng)生

7、長因子（nerve growth factor, NGF）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)，可控制神經(jīng)細胞存活的數(shù)量和分化，維持成熟神經(jīng)元的存活，參與受損神經(jīng)元的修復。此外，NGF可以增強CGRP的表達，刺激CGRP的合成2,3。近年來，許多研究表明，蛋白激酶B(proteih Kinase B,PKB)在腦缺血再灌注損害的病理生理機制中可能扮演重要角色4。本實驗通過檢測PKB的表達，來研究CGRP和NGF對腦缺血再灌注的保護作用及其機制。    1材料與方法1.1腦缺血再灌注模型與分組健康雄性Wistar大鼠30只，體重300350g，由沈陽醫(yī)學院實驗動物

8、中心提供。分設(shè)假手術(shù)組、缺血再灌注組、NGF組、CGRP組、NGF與CGRP合用組(N&C組),每組6只大鼠。根據(jù)Nagasawa線栓法制作右側(cè)大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，實驗大鼠以0.4%戊比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠固定于手術(shù)操作臺,作頸前正中切口,游離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)、外動脈后結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈起始部,于頸總動脈分叉部下方剪一小口,將一預(yù)先燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈,向上至遇到輕微阻力為止(一般線的頭端已達大腦中動脈起始部)以栓塞血管。由頸總動脈分叉部起始,其插入的深度平均為(20.5±0.5)mm。栓塞90 min后回抽出線栓約10 mm

9、,恢復再灌注。其它各組分別向頸動脈內(nèi)注入NGF（500 U/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）和NGF（500U/ml，0.5ml）30min注射完。此后分別于24 h后處死取材。手術(shù)過程中常規(guī)檢測肛溫,使肛溫保持在(37.0±0.5)。大鼠術(shù)畢清醒后,觀察其行為學變化,按ZeaLonga評分標準將動物的行為變化分為5級:0級,行為無明顯變化;1級,左前肢屈曲,左后肢伸展;2級,有左側(cè)追尾現(xiàn)象;3級,行走困難,搖擺不定;4級,意識不清。將1、2、3級動物定為模型成功大鼠,0、4級棄去不用。假手術(shù)組僅夾閉右側(cè)頸總、頸外動脈以中斷血

10、流90min,術(shù)后未見行為異常。用4%多聚甲醛灌注，常規(guī)冰凍切片。1.2電鏡實驗結(jié)束后,將各組大鼠斷頭處死,迅速取出海馬,按電鏡樣品取材要求,3%戊二醛、1%鋨酸雙固定,常規(guī)包埋,光鏡選區(qū),制備超薄切片,鈾、鉛雙染,100CX 型透射電鏡觀察。1.3免疫組織化學染色腦的冠狀切面冰凍切片，片厚12m。常規(guī)HE染色,光鏡下觀察假手術(shù)組及缺血組的組織學變化，采用免疫組化SABC法檢測大腦皮質(zhì)及海馬PKB的表達。多克隆PKB抗體（兔抗大鼠，Santa Cruz,中國Boster公司代理）以1：100稀釋，按SABC試劑盒（Boster公司）說明操作。陽性對照實驗磷酸驗緩沖液代替一抗進行免疫組化染色。用

11、圖像分析儀取每張切片每個部位各測5個相同單位面積的平均灰度值。1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用t檢驗并進行統(tǒng)計學處理。    2結(jié)果2.1電鏡假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元核比較大、呈圓形或橢圓形,核膜清晰、完整,核質(zhì)電子密度低,常染色質(zhì)多,呈細顆粒狀,分布均勻,核仁呈網(wǎng)狀,居中;胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富,線粒體呈橢圓形或桿狀,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)散在分布,結(jié)構(gòu)清晰。缺血再灌注組可見核染色較淺,核仁增大且致密,胞質(zhì)水腫,線粒體腫脹、嵴斷裂,基質(zhì)電子密度增高,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒;軸突內(nèi)線粒體空泡樣變,髓鞘分層、散亂。神經(jīng)元胞體水腫,核膜斷裂、模糊不清或崩解,異染色質(zhì)增多,核仁濃密,胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜模糊、不連續(xù),嵴斷裂、溶解、消失呈空泡化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫、擴張、脫顆粒。有的神經(jīng)元部分核膜清晰,核周隙增寬,部分核膜溶解,染色質(zhì)呈團塊狀凝集,核仁碎裂;胞質(zhì)內(nèi)細胞器明顯減少而致電子密度變低,殘存的線粒體崩解呈空泡狀,但尚可辨認;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,神經(jīng)絲增多,出現(xiàn)細胞凋亡。2.2免疫組化染色及定量分析結(jié)果正常組，PKB在頂葉皮質(zhì)(Brodmann分區(qū)第4區(qū))及海馬CA1區(qū)細胞核內(nèi)無表達，胞漿內(nèi)極少表達；I/R組，PKB表達較sham組有所增加（P<0.05）；CGRP組和NGF組，大腦皮質(zhì)及海馬PKB表達較I