陣列叉指式芯片研究細胞介電電泳富集過程

1、陣列叉指式芯片研究細胞介電電泳富集過程         11-04-23 13:21:00     編輯：studa20              作者：郝敦玲 徐溢 曾雪 曹強 溫志渝 【摘要】  采用陣列叉指電極介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)芯片，構建了集成DEP芯片分析和操控系統(tǒng)，應用Covento

2、rware有限元分析軟件模擬分析了芯片表面的電場分布情況;以紅細胞和結腸癌細胞樣品為分析對象，實現(xiàn)了兩種細胞樣品在芯片上的正負介電電泳定位富集。實驗發(fā)現(xiàn)，交流信號幅值Vpp是決定DEP富集效率的主因，交流信號頻率f和緩沖溶液是改變細胞介電電泳類型的參量;在0.9% NaCl中，施加頻率為10和3 MHz、電壓5 V的交流頻率，結腸癌細胞的正介電電泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)和負介電電泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)富集效率分別為87.2%和84.8%。 【關鍵詞】  芯片介電電泳，細胞富集，陣列叉指電極1 引

3、 言芯片介電電泳(Microchip dielectrophoresis)是以介電電泳分離原理和微機電加工技術為基礎的新型分析技術，在生化樣品分析方面明顯優(yōu)于常規(guī)檢測方法。近年來，芯片介電電泳已從最初的對中性粒子的簡單富集操作，擴展到對細菌、細胞、病毒、納米材料和金屬顆粒等物質的富集、分離和操控等方面14。介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)與流體力5、電場力6、激光鑷子7等模式耦合的研究已有報道，同時將芯片介電電泳技術與其它分析方法耦合也是新的研究方向。芯片介電電泳分析系統(tǒng)的微電極結構是決定其分析性能的關鍵，因此設計出分離性能更高、結構更合理的微電極備受關注。近年來，DEP

4、芯片電極構型已由傳統(tǒng)的平面式電極發(fā)展為三維式電極，出現(xiàn)了夾板式電極、籠式電極和絕緣柱式電極等多種結構8，9。本研究以陣列叉指電極式DEP芯片為核心單元構建DEP芯片分析系統(tǒng)，在對叉指電極表面的電場分布情況和介電電泳力作用范圍進行計算模擬的基礎上，以紅細胞和結腸癌細胞為研究對象，應用構建的DEP芯片分析系統(tǒng)對細胞樣品的介電電泳富集過程進行系統(tǒng)研究，以期為快速高效檢測復雜體系中細胞樣品奠定理論和技術基礎。2 實驗部分2.1 儀器與試劑Agilent 33220A型任意函數(shù)信號發(fā)生器(安捷侖公司); IX71奧林巴斯熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司); Alpha Innotech型微泵(美國

5、Alpha公司); Qcapture pro.圖像采集處理軟件， Camtasia Studio屏幕錄制軟件。Sylgard184有機硅彈性體即聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS;美國道康寧公司)，用于澆注PDMS蓋片。緩沖液配制： 分別精確稱取4.000 g NaCl， 0.100 g KCl， 1.744 g Na2HPO4·12H2O和0.100 g KH2PO4， 溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)?？鼓齽┡渲疲悍Q取EDTA2Na 4.0 g溶解定容于100 mL容量瓶中。0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽。以上試劑均用0

6、.22 m高溫滅菌后的微孔濾膜過濾后備用。樣品：紅細胞(red blood cell, RBC)形狀呈雙面凹陷的圓盤狀，直徑約7.5 m;116型結腸癌細胞(colon cancer cell)呈圓球形，直徑約15 m。所有細胞樣品均由重慶第三軍醫(yī)大西南醫(yī)院臨床檢驗科提供。2.2 實驗步驟2.2.1 陣列叉指電極DEP芯片制作及分析系統(tǒng)搭建 DEP芯片的底片為鍵合有Au電極的玻璃片，陣列叉指電極寬度和間距均為30 m，玻璃底片尺寸為25 mm×17 mm×2 mm，由中國科學院大連化學物理研究所外協(xié)制作。采用PDMS制作DEP芯片的蓋片。將PDMS預聚體和固化劑按質量比10

7、:1混合均勻，澆注于硅烷化處理后的SU8管道陽膜上，脫氣后于60 恒溫干燥箱中固化4 h，室溫冷卻后小心剝離PDMS蓋片，用孔徑為3 mm的打孔器在PDMS蓋片上打孔備用，形成的微管道寬150 m，深30 m，長10 mm。將帶有微管道的PDMS蓋片依次用乙醇、二次蒸餾水、乙醇清洗后風干備用。鍵合Au電極的玻璃底片用丙酮輕輕擦洗并風干，備用。最后將玻璃底片與PDMS蓋片密合，抽負壓吹干，即完成陣列叉指電極式DEP復合式結構芯片的制作，芯片實物和電極構型如圖1所示，芯片分析系統(tǒng)構建如圖2所示。a. 進樣口(Inlet); b. 廢液池(Outlet); c. 注射微泵(Injection mic

8、ropump); d. 注射器(Injection syring); e. 信號發(fā)生器(Signal generator); f. 示波器(Digital oscilloscope); g. 電源控制器(Power controller). 分 析 化 學第37卷第9期郝敦玲等：陣列叉指式芯片研究細胞介電電泳富集過程 2.2.2 影響細胞DEP富集的因素 (1)緩沖介質固定交流信號幅值Vpp為5 V，在不同頻率f下，考察紅細胞在PBS和0.9%NaCl兩種緩沖溶液中的介電電泳富集過程; (2)交流信號幅值Vpp 選擇0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號頻率為10 MHz，考察V

9、pp在110 V范圍逐步變化時，紅細胞和結腸癌細胞的富集過程; (3)頻率f 選擇0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號幅值Vpp為5 V，考察f在120 MHz范圍逐步變化時，紅細胞和結腸癌細胞的富集過程。2.2.3 結腸癌細胞介電電泳富集 以116型結腸癌細胞作為分析對象，緩沖溶液選用0.9% NaCl，細胞濃度為103104 cell/mL，Vpp=5 V，分別在10 MHz和3 MHz條件下，對結腸癌細胞進行DEP富集實驗。3 結果與討論3.1 陣列叉指電極式DEP芯片上電場分布模擬依據(jù)芯片介電電泳原理，通過有限元方法數(shù)字化程序，在建立合適的二維模型基礎之上，模擬不同的幾

10、何結構電極的電場分布，在給定的邊界條件和參數(shù)下，預測電場梯度的變化。這不僅有利于確定最優(yōu)的電極結構，還能確定介電電泳的有效作用區(qū)域10。本實驗采用Coventorware有限元分析軟件對DEP芯片管道內的電場分布進行了模擬。在2 V 1 MHz的交流信號下，電極寬度和間距與芯片實際尺寸相同均為30 m，陣列叉指電極表面不同高度處的E分布情況如圖3所示。當叉指電極寬度和間距為30 m時，電極表面電場梯度分布差異明顯，電場梯度最大的位置出現(xiàn)在叉指電極的邊緣，為細胞受正介電電泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)時的富集位置;電場梯度最小的位置出現(xiàn)在兩電極之間，為細胞受

11、負介電電泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)時的富集位置，故而在此芯片上可以實現(xiàn)細胞樣品在不同位置的DEP富集。從圖3還可以看到，隨著距電極表面距離的增加，E顯著降低，DEP作用力明顯下降。當距離達到30 m時，E接近于零，介電作用力幾乎消失。因此，可確認30 m是DEP力的有效作用范圍，將其作為DEP芯片管道高度可實現(xiàn)對樣品對象的有效DEP操控。3.2 影響細胞介電電泳富集的因素根據(jù)介電電泳原理，細胞所受的介電電泳力F=20mr3RefCM|Erms|2, 其中0和m分別為真空介電常數(shù)和介質介電常數(shù)，|Erms|2為電場強度絕對值的拉普拉斯算符， RefCM為

12、ClausiusMossotti因數(shù)，其中fCM=*p-*m*p+2*m, *p和*m分別代表細胞和緩沖液的綜合介電常數(shù)，*=-i/，其中是介電常數(shù)，i代表-1，是電導率，為外加電場的角頻率。因此，在實驗中可以通過改變緩沖介質配比、外加電場電壓和頻率等參數(shù)來實現(xiàn)粒子的定向操控和分離分析等目的。3.2.1 交流信號幅值Vpp對細胞DEP富集的影響 細胞所受介電電泳力除與電場強度E2成正比外，還與細胞半徑r3成正比。因此，當Vpp相同時，結腸癌細胞的富集速度要明顯快于紅細胞的富集速度。實驗選擇0.9% NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號輸出頻率為10 MHz，實驗考察了不同Vpp時兩種細胞富集的情況。 圖4 紅細胞和結腸癌細胞在不同電壓下的富集時間1. 紅細胞(Red blood cell, RBC ); 2. 結腸癌細胞(Colon cancer cell)。首先界定從開始施加交流信號到細胞DEP富集過程完成細胞不再運動為止的時間為細胞的富集時間t，實驗測得細胞富集時間t隨Vpp的增加而減小，且同一電壓下結腸癌細胞的富集時間明顯小于紅細胞(如圖4)。當Vpp<3 V時，D