第四章大分子的分離和分析(精)

1、第四章大分子的分離和分析第一節(jié)DNA 的分離、檢測和純化本章摘要 DNA 的分離中，質(zhì)粒的分離是最多的，主要使用堿裂解法。 DNA 凝膠電泳有瓊脂糖凝膠電泳和 PAGE 兩種。從瓊脂糖凝膠中回收 DNA 的方法很多， 根據(jù)待回收的 DNA 片段大小選擇合適的方法。 RNA 的分離純化主要是避免 RNA 酶的污染而降解目標(biāo)分子。分子雜交根據(jù)雜交的對象可以分為Southern、Northern和Western雜交，分別是 DNA 和 DNA ， DNA 和 RNA ，蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的雜交。雜交的過程分為：轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交洗膜和檢測等步驟。 DNA （或 RNA ）探針的標(biāo)記方法很多，主要有：均勻

2、標(biāo)記、單鏈探針標(biāo)記和末端標(biāo)記。 不同的標(biāo)記方法適用于不同的分子， 標(biāo)記方法不同要求的工具酶也不一樣。常見的標(biāo)記物有放射性同位素和生化酶兩種。DNA是基因的物質(zhì)載體，這些載體和基因絕大多數(shù)是以質(zhì)粒的形式保存在大腸桿菌中，基因操作是從大腸桿菌開始的。一、 E.coli 質(zhì)粒DNA 的分離和純化1堿裂解法提取E.coli 質(zhì)粒DNA的方法堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法是經(jīng)典的方法，由 Birnboim和 Doly 設(shè)計并于1979 年發(fā)表。溶液（ solution）：懸浮細(xì)胞。該溶液中含有50mM 的葡萄糖。溶液 ： 2 倍溶液 體積。該溶液含有0.2N NaOH和 1% SDS 。在這種情況下，細(xì)胞

3、會很快破裂，使混濁的細(xì)胞懸液變成完全澄清的粘稠液體。此時，由于在pH12.0-12.5這樣狹小的范圍內(nèi)，線性染色體DNA發(fā)生變性，而質(zhì)粒DNA （ cccDNA ）不會變性。溶液 ： 1.5 倍溶液 體積。該溶液為高濃度的醋酸鉀緩沖液（ 3M, pH4.6 ）。在中和過程中，高分子量的染色體DNA復(fù)性并聚積成不溶的沉淀，同時高濃度的鹽引起蛋白質(zhì)與SDS 復(fù)合物以及大分子的RNA形成沉淀。 而質(zhì)粒DNA是環(huán)狀的， 在變性之后經(jīng)過中和仍保持環(huán)狀，處于可溶解狀態(tài)。經(jīng)高速離心，上清液即為質(zhì)粒DNA粗制品。2通過試劑盒分離純化E.coli 質(zhì)粒DNA操作過程如圖4-1 。二、 DNA 的電泳檢測1瓊脂糖

4、凝膠電泳檢測DNA是否真的存在， 是否有降解現(xiàn)象， DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后其產(chǎn)物的大小。目前最成熟的檢測 DNA 的技術(shù)是瓊脂糖凝膠電泳。瓊脂糖從海藻中提取的一種線狀高聚物，在 0.7% 的瓊脂糖濃度下，對 0.8 10kb 的 DNA 有最佳的分離效果。上樣緩沖液：含有40% 的蔗糖，用于將DNA樣品沉積在點樣孔內(nèi)，使樣品不易擴散；還含有溴酚蘭等指示劑，用于觀察電泳的進程。電壓：DNA樣品都是約pH8.0 進行保藏或分析的，在這一pH負(fù)電的。因此DNA的泳動方向是從負(fù)極走向正極。一般電場的大小為條件下，5 伏DNA是帶/ 厘米左右。DNA構(gòu)象：質(zhì)粒DNA有三種構(gòu)象，即閉合環(huán)狀超螺旋（ c

5、cc型）、缺口環(huán)狀（nick ）和線狀，它們的泳動速率依次遞減。染色：溴化乙啶可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中，在紫外光的激發(fā)下會發(fā)出橙紅色的熒光，可用于對DNA進行染色和觀察。2聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳可很好的分離100bp-1kb 大小的核酸分子，對單鏈核酸來說，其分辨率可達1bp 。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N， N- 亞甲雙丙烯酰胺經(jīng)過聚合而成的高分子聚合物，其聚合度由濃度和二者的比例決定。一般在變性條件下使用，主要用來檢測小分子核酸的大小，或在同位素標(biāo)記的情況下分析單鏈核酸，如分離寡核苷酸探針、S1 核酸酶產(chǎn)物分析和 DNA測序等。三、 DNA 片段的純化（從ag

6、aroe）1低熔點瓊脂糖凝膠電泳法低熔點瓊脂糖在水溶液中的溶解溫度（ melting point ）很低，在65 以下；當(dāng)溫度降低到 20-30 時凝結(jié)成固形物。如果需要分離特定的DNA片段，可用低熔點瓊脂糖凝膠進行分析，然后切割帶有目標(biāo)DNA的瓊脂糖凝膠塊，加入適量緩沖液，加熱到60 ，凝膠溶化，DNA進入水溶液中，最后通過苯酚/ 氯仿抽提和乙醇沉淀獲得純化的DNA片段。2透析袋電洗脫法將含有目標(biāo) DNA 片段的瓊脂糖凝膠塊切割下來， 放在透析袋中， 置于電泳緩沖液中電泳， DNA 將從凝膠塊中 “跑 ”出來。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。3 Glass Milk（ bead）結(jié)

7、合法瓊脂糖凝膠在3 倍體積的3M NaI溶液作用下于55 會溶化， 從而將DNA釋放到水溶液中；在這樣的高鹽濃度下，有一種硅珠 （ glass bead ，硅的細(xì)微顆粒，其水溶液呈牛奶狀，故亦稱玻璃奶， glass milk ）可特異性吸附 DNA 。當(dāng)硅珠吸附 DNA 后，通過離心的方法很容易對硅珠進行洗滌，然后用水或低鹽緩沖液可從硅粒中將吸附的 DNA 洗脫出來。4 Qiagen純化柱第一節(jié)RNA的分離、檢測和純化在細(xì)胞中除了DNA外還有 RNA,即 rRNA、 tRNA 和 mRNA。對于基因操作來說，涉及到的RNA主要是mRNA，而 mRNA在細(xì)胞中的含量又是最少的。一個典型哺乳動物細(xì)

8、胞約含10-5mgRNA ，其中80-85% 為 rRNA（ 28S,18S 和 5S 三種 rRNA），其余 15 20% 主要由各種類型的低分子量RNA 組成（如 tRNA ，核內(nèi)小分子 RNA 等）。 mRNA為總 RNA的 1 5% 。同時由于 mRNA 是單鏈的，容易受到核酸酶的攻擊，導(dǎo)致在RNA 的操作過程中易于遭遇降解的厄運。 因此，對 RNA 的操作要求比 DNA 的操作更嚴(yán)格， 操作時必須設(shè)置專門的處理方法和程序。一、注意事項-控制潛在的 RNA 酶的活性1用具和溶液的去RNA 酶處理用 0.1% 焦碳酸二乙酯 （ DEPC）處理過的水浸泡后再滅菌， 或購買無 RNA 酶污染

9、的用具。對于電泳用具最好使用專用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗滌劑洗涮干凈，再用 3%H 2O2 和 0.1% DEPC 處理的水浸泡，清洗干凈。2 RNA 酶抑制劑的使用為了進一步防范RNA 降解，一般在RNA 樣品和 RNA 反應(yīng)中加入RNA 酶抑制劑，現(xiàn)在應(yīng)用較多的是蛋白類抑制劑，如人胎盤RNase 抑制劑。除此之外，還有氧銅核糖核苷復(fù)合物（完全抑制劑，且抑制體外翻譯）和硅藻土（吸附RNase 吸附劑）。二、 RNA 的抽提和純化1酚 -異硫氫酸胍抽提法TRIZOL 試劑是使用最廣泛的抽提總RNA 的專用試劑， 由 Gibco公司根據(jù)酚-異硫氫酸胍抽提法設(shè)計，主要由苯酚和異硫氫酸胍

10、組成。對任何生物材料的RNA 提取，首先研磨組織或細(xì)胞，或使之裂解；加入該試劑后，可保持RNA 的完整，同時進一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分；加入氯仿抽提，離心，水相和有機相分離；收集含RNA 的水相；通過異丙醇沉淀，可獲得RNA 樣品。2硅膠膜純化法RNeasy 試劑盒是由Qiagen公司設(shè)計，其設(shè)計思路與DNA 的分離純化思路相似（見圖 8.1 ） ，也就是含有目標(biāo)核酸的細(xì)胞破碎液通過硅膠膜時，核酸吸附在硅膠膜上，從而與其它細(xì)胞成分分開，然后在低鹽濃度下核酸可從硅膠膜上洗脫出來。三、 mRNA的純化mRNA的純化主要是針對真核生物而言的，由于真核生物 mRNA 的poly（ A） 尾，可用親和

11、層析的方法純化。 有許多類型的商業(yè)化層析柱可用于3'端有一個mRNA 的純化。四、 RNA 的電泳檢測RNA 的濃度和純度可通過測試其OD260 來判斷， OD260 為 1時相當(dāng)于濃度為mg/ml 。而要直觀地觀察RNA 的存在以至于分析，可通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝40膠電泳來完成。1瓊脂糖凝膠電泳通過瓊脂糖凝膠電泳進行RNA 分析和 DNA 分析的原理是類似的。不同的是， RNA分析是在變性的條件下進行的。常用的變性劑為甲醛， 也可使用氫氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亞砜（ DMSO）。2聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用來分析小分子量的單鏈核酸，如小分子量RNA 寡核

12、苷酸、 DNA 序列分析等。其變性條件可用加熱方式，或使用尿素等變性劑。第三節(jié)蛋白質(zhì)的SDS-PAGE一、檢測蛋白質(zhì)的分子量（見實驗）二、Western blot （見本章第四節(jié)）三、蛋白質(zhì)氨基端序列測定3.1 電泳3.2 轉(zhuǎn)膜PVDF3.3 染色、脫色3.4 干燥、檢測第四節(jié)分子雜交分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在， 以及其分子量大小。 根據(jù)其檢測對象的不同可分為 Southern 雜交、Northern 雜交和 Western 雜交，以及由此而簡化的斑點雜交、 狹線雜交和菌落雜交等。一、 Southern blottin

13、g1轉(zhuǎn)膜當(dāng)目標(biāo) DNA 經(jīng)過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳以后，在 0.4N NaOH 堿性條件下變性，再在1.5M NaCl/1M Tris（ pH7.4 ） 條件下中和使DNA 仍保持單鏈狀態(tài)。然后通過毛細(xì)管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上。最后通過80 處理或紫外線照射將DNA 固定在濾膜上。圖4-2 是通過毛細(xì)管滲吸法進行 Southern blotting的經(jīng)典裝置圖。2分子雜交2.1預(yù)雜交將結(jié)合了 DNA 分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進行預(yù)雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精 DNA 或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。

14、2.2雜交在一定的溶液條件和溫度下， 將標(biāo)記的核酸探針與濾膜混合， 如果濾膜上的 DNA 分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。2.3洗膜經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去。3檢測3.1放射性標(biāo)記、檢測在分子克隆操作中用于標(biāo)記核酸分子的標(biāo)記物主要是放射性同位素，如32P， 33P和 35S 。在摻入核苷酸的標(biāo)記過程中，只有三磷酸核苷酸的 位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用 位磷酸被標(biāo)記的三磷酸核苷酸，如 - 32 PdATP。而在標(biāo)記 5'末端磷酸基團的反應(yīng)中一般使用 位磷酸被標(biāo)記的ATP 。放射性的信號通過 X-光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。3.

15、2非放射性標(biāo)記、檢測。其中應(yīng)用最成功的是原德國寶靈曼公司開發(fā)的地高辛（ digoxygenin,DIG） 標(biāo)記核酸探針。將 DIG 與 dUTP 交聯(lián)，在參入核苷酸的標(biāo)記反應(yīng)中用DIG-11-dUTP（或DIG-11-UTP）取代 dTTP （或 rTTP ），使探針 DNA 或 RNA 分子被 DIG標(biāo)記。 DIG 標(biāo)記的檢測是該技術(shù)的核心，即利用抗 DIG 的抗體通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)來完成。將抗 DIG 的抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)，通過免疫反應(yīng)將堿性磷酸酶攜帶到目標(biāo)核酸分子處，在加入顯色劑BCIP/NBT（5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚磷酸鹽 / 鹽酸氮藍四唑）后堿性磷酸酶與顯色劑反應(yīng)形成濃紫

16、色偏棕色沉淀，從而顯示出目標(biāo)分子的有無和位置。圖4-3是通過地高辛標(biāo)記探針的Southern雜交實例。M，地高辛 （ DIG）標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)（ lDNA/ Hin d）； 1-3 ，蘇云金芽胞桿菌YBT-1520菌株的總 DNA 分別經(jīng)Kpn Pst 、 Pst 和Kpn 酶切。以cry1Aa 殺蟲晶體蛋白基因中的 728bp片段作探針，通過隨機引物標(biāo)記的方式，用DIG 標(biāo)記探針。結(jié)果顯示，該菌株至少含有兩個殺蟲晶體蛋白基因，而且其拷貝數(shù)明顯不同。預(yù)示至少其中一個基因位于多拷貝的質(zhì)粒上。圖 4-3：通過地高辛標(biāo)記探針的Southern通過放射自顯影或生化檢測，就可判斷濾膜上是否存在與探針同源

17、的其分子量。 Southern雜交主要用來判斷某一生物樣品中是否存在某一基因，在的限制性酶切片段的大小。應(yīng)用該技術(shù)的前提是必須要有探針。4探針的標(biāo)記雜交結(jié)果DNA 分子及以及該基因所在一個核酸樣品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子雜交來檢測，但首先要有一段與目標(biāo)核酸分子的序列同源的核酸片段。將該片段標(biāo)記后與樣品核酸進行分子雜交，通過檢測標(biāo)記核酸的存在從而判斷樣品中特定核酸片段的存在。 用作檢測的核酸片段即為探針 （ probe ） 。4.1均勻標(biāo)記間接標(biāo)記不是標(biāo)記探針分子本身， 而是復(fù)制一段新的探針分子， 在復(fù)制過程中摻入標(biāo)記的核苷酸（如 - 32 PdATP ），從而使整個新分子被均勻

18、地標(biāo)記。切口平移標(biāo)記這種標(biāo)記方式目前只有通過大腸桿菌DNA 聚合酶 來完成，只有該酶具有5'-3'外切活性。 通過在待標(biāo)記的DNA 分子上產(chǎn)生切口，該酶引發(fā)5'-3'外切反應(yīng)， 在隨后的 5'-3'DNA 聚合反應(yīng)中若存在標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸（ dNTP），新合成的核酸鏈就帶有標(biāo)記物。在整個標(biāo)記反應(yīng)體系中，待標(biāo)記的DNA 分子的任何一條鏈中的任何位點（除靠近 5'端外）都可能作為標(biāo)記反應(yīng)的起始點，并持續(xù)到該鏈的3'末端。 因此， 新合成的被標(biāo)記的分子可以代表該待標(biāo)記的DNA 分子的絕大部分核苷酸序列。隨機引物標(biāo)記利用由 6個核苷

19、酸組成的序列隨機的寡核苷酸為引物，在Klenow酶的作用下對目標(biāo) DNA 進行隨機擴增。 這樣擴增出來的DNA 產(chǎn)物包括從任意某個位點（可能最靠近5'的一些核苷酸除外）起始的單鏈DNA 片段，其整體應(yīng)該包含了目標(biāo)DNA 所有核苷酸序列信息。在擴增中加入標(biāo)記的dNTP ，擴增出來的DNA 產(chǎn)物就可用作探針。該方法多用來標(biāo)記一個 DNA 片段。PCR 擴增標(biāo)記在 PCR擴增時加入標(biāo)記的 dNTP ，不僅能對探針 DNA 進行標(biāo)記還可進行大量擴增，尤其適合于探針 DNA 濃度很低的情形。4.2單鏈探針單鏈 DNA 探針單鏈 DNA 探針是通過單鏈模板來制備的。首先將待標(biāo)記的雙鏈DNA 連接到

20、 M13噬菌體載體或噬菌粒載體上，制備其單鏈DNA ,然后以單鏈DNA 為模板，以對應(yīng)于載體上插入位點兩端序列之一的通用引物為引物，在有標(biāo)記的dNTP 存在下，通過Klenow DNA 聚合酶合成單鏈DNA 。經(jīng)過分離純化后即可得到高質(zhì)量的帶標(biāo)記的單鏈DNA 探針。單鏈 RNA 探針在有些質(zhì)粒載體的多克隆位點兩端帶有噬菌體的啟動子，例如pGEM-3 和pBluescript 系列載體分別含有T7/SP6噬菌體啟動子和T7/T3噬菌體啟動子。 將待標(biāo)記的 DNA 片段插入載體的多克隆位點，在轉(zhuǎn)錄區(qū)下游選擇一個酶切位點，用限制性內(nèi)切酶將載體線性化以防止轉(zhuǎn)錄出載體的序列和多聯(lián)體產(chǎn)物。加入對應(yīng)的噬菌體

21、RNA 聚合酶，rNTP 和某個標(biāo)記的rNTP在體外進行轉(zhuǎn)錄，合成出標(biāo)記的單鏈RNA 。利用無 RNA 酶活性的 DNA 酶處理以及后續(xù)純化步驟可獲得純化的單鏈RNA 探針。單鏈RNA 探針的制備不僅比單鏈 DNA 探針更容易，而且其產(chǎn)生的雜交信號更強。4.3末端標(biāo)記直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子， 或直接在探針分子上加入標(biāo)記的原子或復(fù)合物，這種直接標(biāo)記一般是在探針分子的末端進行標(biāo)記，亦稱末端標(biāo)。DNA 片段的末端標(biāo)記末端標(biāo)記主要通過酶促反應(yīng)來完成，但標(biāo)記的方式很多。如Klenow DNA 聚合酶和T4 或 T7 DNA 聚合酶在對DNA 片段進行末端補平反應(yīng)或平末端的置換反應(yīng)

22、時可引入標(biāo)記的核苷酸，T4多核苷酸激酶可在DNA 的 5'末端引入標(biāo)記的磷酸基團或?qū)?'末端的磷酸基團用標(biāo)記的磷酸基團置換，末端轉(zhuǎn)移酶可在DNA 的 3'末端連接標(biāo)記的核苷酸。寡核苷酸的標(biāo)記合成的寡核苷酸主要通過記，也可利用末端轉(zhuǎn)移酶在3'T4 多核苷酸激酶在末端連接標(biāo)記的核苷酸。5'末端引入標(biāo)記的磷酸基團進行標(biāo)二、原位雜交原位雜交就是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對濾膜上的菌體進行原位裂解使DNA 釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個或哪些菌落含有與探針同源的DNA 。菌落雜交主要用來從用質(zhì)?；?/p>

23、Cosmid 構(gòu)建的基因文庫中尋找陽性克隆子，當(dāng)?shù)玫疥栃钥寺∽雍螅偻ㄟ^Southern雜交進一步驗證。通過這種方法在一張直徑為9cm 的濾膜上，可檢測成幾百到一千甚至上萬個菌落，達到高通量篩選的目的。斑點雜交是分子雜交中最簡單的一種，直接將 DNA 或 RNA 分子以斑點的形式固定在濾膜上， 然后進行分子雜交。其雜交的信號比菌落雜交和噬菌斑雜交受到蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分的干擾小， 其結(jié)果的可靠性更強。 當(dāng)核酸分子的斑點面積變得更小， 在單位面積濾膜上處理的樣品數(shù)量就更多，當(dāng)檢測的靈敏度進一步提高后，就發(fā)展成 DNA 芯片。四、 Northern blotNorthern轉(zhuǎn)移的是RNA 而不是個與

24、Southern blotting雜交的總體過程與DNA , 這種將 RNA對應(yīng)的名稱，Southern雜交相似，只不過在Blotting過程中樣品從凝膠轉(zhuǎn)移濾膜的方法，其設(shè)計者為之起了一Northern blotting。其后的分子雜交過程與Southern雜交過程中的分子雜交方式是一樣的。Northern雜交主要用來檢測細(xì)胞或組織樣品中是否存在與探針同源的mRNA 分子，從而判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達，在有合適對照的情況下，通過雜交信號的強弱可比較基因表達的強弱。五、 Western blotWestern雜交的總體過程也與Southern雜交相似，只不過在 Blotting過程中轉(zhuǎn)移

25、的是蛋白質(zhì)而不是DNA ，這種將蛋白質(zhì)樣品從SDS-PAGE 凝膠通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到濾膜的方法，稱為Westernblotting。其后的雜交過程不是真實意義的分子雜交，而是通過抗體以免疫反應(yīng)形式檢測濾膜上是否存在被抗體識別的蛋白質(zhì)，并判斷其分子量。所用的探針不是 DNA 或 RNA， 而是針對某一蛋白質(zhì)制備的特異性抗體。Western雜交主要用來檢測細(xì)胞或組織樣品中是否存在能被某抗體識別的蛋白質(zhì)，從而判斷在翻譯水平上某基因是否表達。這種檢測方法與其它免疫學(xué)方法的不同是，一方面可以避免非特異性的免疫反應(yīng)，而且更關(guān)鍵的是可以檢測出目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量，從而直觀的在濾膜上顯示出目標(biāo)蛋白。六、蛋白質(zhì)

26、N 末端序列測定七、 RNA 端點分析1 RNA 的 S1核酸酶作圖對 mRNA的端點進行分析之前必須知道 mRNA 的核苷酸序列， 也就是必須獲得該基因的核苷酸序列。 首先預(yù)先判斷 mRNA 的端點位置， 設(shè)計一段覆蓋該端點的寡核苷酸， 并作末端放射性標(biāo)記。 然后將該標(biāo)記的寡核苷酸與 mRNA 混合， 退火，形成雜交體。 在 S1 核酸酶作用下，呈單鏈狀態(tài)的 DNA 和 RNA 被降解，保留 DNA-RNA 雜交體雙鏈，最后通過凝膠電泳檢測 DNA-RNA 雜交體中標(biāo)記的DNA 單鏈的分子量大小，從而推斷mRNA 的末端序列。 其工作原理見圖4-4。這種方法既可以分析mRNA 的 5 

27、9;端也可分析3 '端。2引物延伸法分析mRNA 的端點引物延伸（ primerextension）法主要用于mRNA 的 5 ' 末端作圖，先要知道該基因的核苷酸序列并預(yù)先判斷mRNA 的端點位置。首先在mRNA 的預(yù)測的5 '末端下游約150bp 位置處， 設(shè)計一段互補寡核苷酸引物。以 mRNA 作模板，用反轉(zhuǎn)錄酶延伸該引物，生的 cDNA 與 mRNA 模板互補且其長度與引物5 '末端至 mRNA 的 5'末端之間的距離相等。產(chǎn)第五節(jié)生物芯片技術(shù)一、生物芯片的定義生物芯片（ Biochip ）是指通過機器人自動印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、

28、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實現(xiàn)對細(xì)胞、 蛋白質(zhì)、 基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測?；蛐酒?（又稱 DNA 芯片）是生物芯片的一種類型，它是將 DNA 分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過自動化儀器檢測雜交信號的強度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進而得知樣品中mRNA 的表達量， 也可進行基因突變體的檢測和基因序列的測定，為進一步了解基因間的相互關(guān)系及基因克隆提供有用的工具。二、基因芯片技術(shù)的發(fā)展史1989 年英國牛津大學(xué)的Southern等取得了在剛性載體表面固定寡聚核苷酸及雜交

29、法測序的專利； 與此同時俄羅斯和美國的科學(xué)家也提出了運用雜交法測定核酸序列（SBH）的設(shè)想。 1994年研制出了一種基因芯片并用于檢測 - 地中海貧血病的基因突變，篩選了一百多個 - 地中海貧血病已知的突變基因。1995年，一些國際大公司與研究機構(gòu)合作共同開發(fā)具有商業(yè)價值的生物芯片及其相關(guān)的分析技術(shù)。1997年世界上第一張全基因組基因芯片含有6116個基因的酵母全基因組芯片在斯坦福大學(xué)Brown實驗室完成。從而使基因芯片技術(shù)在世界上快速得到應(yīng)用。三、基因芯片技術(shù)的特點基因芯片技術(shù)的特點的核心是微型化。芯片每平方厘米固體表面上可固定十萬個DNA 片段、數(shù)萬個基因。 一次分析可得到數(shù)萬個基因的表達

30、信息。 微型化的另一方面是樣品用量與試劑用量的微量化， 用納克級的 mRNA 、微升級的雜交液就能分析成千上萬個基因的表達信息。這些都是其它研究技術(shù)所無法比擬的。芯片制作及分析過程易于自動化。 芯片設(shè)計制作可實現(xiàn)自動化， 可根據(jù)要求將需要分析的基因制作成符合要求的芯片； 雜交、洗片等過程都可實現(xiàn)自動化， 工作效率大幅提高。四、生物芯片的分類1按載體材料按載體材料可將芯片分為玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、熒光背景低、 應(yīng)用方便等優(yōu)點在國際上被廣泛接受。通常是將玻片用化學(xué)方法處理并聯(lián)接上活性基團，如氨基、醛基、巰基等，使生物分子通過共價鍵或離子鍵與載體結(jié)合。2按點樣方式根據(jù)芯片

31、點樣方式不同，可分為原位合成芯片、微矩陣芯片和電定位芯片三類。 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip） 矩陣芯片（ Microarray） 電定位芯片（Microelectronic）3按芯片固定的生物分子類型根據(jù)芯片固定的生物分子類型可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質(zhì)芯片及芯片實驗室。 基因芯片或DNA 芯片 蛋白質(zhì)芯片（Protein Chip） 芯片實驗室（Lab-on-Chip ）4按芯片使用功能分類生物芯片因功能和用途不同可分為測序芯片、表達譜芯片和基因差異表達分析芯片等。 測序芯片 表達譜芯片 基因差異表達分析芯片五、基因芯片的制作1 DNA 樣品的來源2

32、生物芯片的制作生物芯片微陣列的制作技術(shù)按照制作方法可分為兩大類，即原位合成和預(yù)合成后點樣。預(yù)合成后點樣是指制備芯片微陣列前，要固定的探針已經(jīng)合成好，點滴系統(tǒng)需要做的就是把這些合成好的樣品涂印或噴涂在基體上。 原位合成方法則是由點滴系統(tǒng)將探針的組成部分逐步轉(zhuǎn)移到基體上， 同時實現(xiàn)探針合成和轉(zhuǎn)移的目的。 目前已經(jīng)知道的基因芯片制作法有，接觸點樣法、噴墨法和原位合成法等。 接觸點樣法 噴墨法 光刻 DNA 合成法3制作生物芯片常用的工具4 DNA 分子在剛性表面的固定基因芯片技術(shù)包括三大部分，即芯片的制作； 樣品的標(biāo)記； 探針與標(biāo)記樣品的分子雜交等。基因芯片制作的關(guān)鍵就是如何將大量的探針分子固定于支

33、持物上，的構(gòu)像處于自然狀態(tài)，使探針 DNA 分子能自由地與樣品分子進行雜交。并保持探針分子六、基因芯片的雜交及結(jié)果分析將不同條件下從某生物體中轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA 經(jīng)標(biāo)記成為探針后， 再與包含它所有基因而制成的芯片雜交。通過分析雜交位點及其信號強弱，就可得出不同情況下每個基因是否已表達及表達多少。1探針的標(biāo)記標(biāo)記的方法通常是在反轉(zhuǎn)錄的底物中加入帶有標(biāo)記基團的寡核苷酸單體，通過反轉(zhuǎn)錄將標(biāo)記分子摻入cDNA 分子中。mRNA 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記方法直接影響DNA 芯片分析結(jié)果的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性。2雜交在一定的條件下， 分子間氫鍵的斷裂與恢復(fù)是結(jié)合的根本動力，這一過程稱之為雜交。DNA/DNA 、 DNA/

34、RNA 分子間選擇性3芯片結(jié)果讀取與掃描儀4生物芯片的軟件系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理七、基因芯片的應(yīng)用1基因表達分析；2基因型及多態(tài)性分析；3雜交測序；4核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究；5疾病的診斷與治療；6藥物開發(fā)；7在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用；8在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。第六節(jié)RNAi技術(shù)一、什么是RNAiRNA 干擾（ RNAinterference ，RNAi）是由雙鏈 RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在 mRNA 水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因表達或使其沉默的過程。 dsRNA 可以抑制不同類型細(xì)胞的靶向基因表達， 用特異性的抗體幾乎檢測不到靶向基因所表達的蛋白質(zhì)。 因此， RN

35、Ai 技術(shù)又被形象地稱為基因敲低（ knock-down ）或基因沉默（ gene silencing ）。 RNAi 是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法， 又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默 （ post-transcriptional gene silencing ，PTGS）。 RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于生物界中。它在真菌中被稱為 quelling ，在擬南芥、煙草等植物中被稱為 PTGS 或共抑制（ co suppression ），在無脊椎動物如果蠅、水螅、線蟲以及脊椎動物斑馬魚、 小鼠等動物界中被稱為 RNAi 。 PTGS 物等普遍存在的一種古老、保守而又極其重要的遺傳行為?？赡苁巧锝纾?包括植物和

36、動二、 RNAi 的發(fā)現(xiàn)1995 年， Guo 等把 par-1基因的反義RNA 注射進秀麗新小桿線蟲性腺的合胞體細(xì)胞中后，在受注射的親本及其子一代的體細(xì)胞中，產(chǎn)生了par-1基因功能缺失型或基因敲除型的表型。奇怪的是僅注射par-l基因的正義RNA 鏈后， par-1基因表達也同樣受抑制。1998 年 Fire等證實，在以秀麗新小桿線蟲為材料的實驗中，強烈而特異的基因表達抑制是由dsRNA 介導(dǎo)產(chǎn)生的。他們發(fā)現(xiàn)，純化后的單鏈RNA（ single strandedRNA，ssRNA）很難導(dǎo)致基因敲除型的表型。Guo 等的實驗中觀察到的所謂“ssRNA 導(dǎo)致同源基因沉默”的現(xiàn)象，事實上是由于制

37、備ss-RNA 時混有的微量的互補型ssRNA 所致。由于當(dāng)時不清楚為何dsRNA 產(chǎn)生此作用， 所以 Fire等將這種由dsRNA 引發(fā)的特定基因表達受抑制現(xiàn)象稱為RNAi。這是有關(guān)生物界存在RNAi現(xiàn)象的首次報道。1999 年， Hunter等的實驗進一步驗證了RNAi的存在。他們將dsRNA 去除后，再將正義或反義的ssRNA 注入線蟲卵中，沒有產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。相反，如果將上述正義及反義 ssRNA 混合，經(jīng)退火復(fù)性后得到的dsRNA 注人線蟲卵中可以顯著地產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，從而印證了Fire等提出的 RNAi作用是由 dsRNA 引起的結(jié)論。隨后， RNAi技術(shù)被成功地應(yīng)用到某些哺乳

38、動物細(xì)胞中，展示了此項研究更為廣闊的應(yīng)用前景。三、 RNAi 的作用機制RNAi 發(fā)揮作用的過程可分為兩個階段，即起始階段和效應(yīng)階段。在起始階段，雙鏈 RNA 分子進入細(xì)胞后被稱為Dicer的核酸酶切割為21-23 個核苷酸長的小分子干擾RNA 片段（ small interfering RNA, siRNA）。 Dicer核酸酶屬于RNase 家族，能夠特異識別雙鏈 RNA ，產(chǎn)生的小片段 RNA 的 3'端都有 2個突出堿基。 然后雙鏈 siRNA與核酶復(fù)合物結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（ RNA-inducedsilencingcomplex, RISC）。隨后進入 RNA

39、干擾效應(yīng)階段，即siRNAs打開雙鏈從而激活RISC ，激活的 RISC 通過堿基配對與對應(yīng)的 mRNA 結(jié)合，并在距離 siRNA 3'端 12個堿基的位置切割 mRNA 。同時，siRNA 可作為引物并以 mRNA 為模板合成新的dsRNA 。這樣又可進入上述循環(huán)，繼續(xù)對目的 mRNA 進行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。 確切切割機制尚不明了，但每個 RISC 都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的核酸酶。四、 RNAi 的特點1 siRNA 的結(jié)構(gòu)和功能之間存在相關(guān)性。dsRNA 經(jīng)過切割形成 20 25nt 的 siRNA ，它們具有 5'末端的磷酸

40、基，3' 末端的羥基和 2個突出的單鏈核苷酸。這種結(jié)構(gòu)對于 RNAi 是十分必要的。 Nykanen等的研究表明平末端的siRNA 或失去 5'磷酸基團的 siRNA 不具有 RNAi的功能。所以， siRNA 的三大結(jié)構(gòu)特征是： 長度為21 23nt 、雙鏈兩端各有兩個突出的 3'堿基、 5'端有磷酸基團。這些特征使得 siRNA有別于其它的 dsRNA ，這也是細(xì)胞能夠區(qū)分出真正的siRNA 和其它 dsRNA 的分子基礎(chǔ)?；?RNAi 的這一特性，細(xì)胞可以自行監(jiān)控異常的mRNA ，并封閉該基因的表達。2 RNAi 的特異性。眾多實驗結(jié)果表明： 導(dǎo)入生物體

41、的 siRNA 只能引起同源基因表達的抑制， 而無關(guān)基因不受影響。而且，在 siRNA 序列中配對的 19 21nt 中如果只改變一個核苷酸，就可以使該 siRNA 序列不對靶 mRNA 起作用，證明 RNAi 有明顯的特異性?？茖W(xué)家可以通過制備外源性的 siRNA 并導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)， 特異性地抑制某些基因的過度表達和抑制突變基因的表達，研究基因的功能。3 RNAi 的高效性。dsRNA 在 DICER 作用下形成 siRNA ，siRNA 解鏈與 RISC 形成復(fù)合物， 這些 RISC 可專一性地與靶向的 mRNA 特異性結(jié)合。 siRNA 也有可能不與 RISC 結(jié)合，而是通過解鏈直接靶向結(jié)合 mRNA 。根據(jù) RISC 結(jié)合位點或單鏈 siRNA 結(jié)合位點在 RdRP 作用下可形成新的 dsRNA ，后者被 DICER 特異識別而將dsRNA 切斷，形成新的靶向 mRNA 。切斷后的mRNA 或被核酸外切酶所降解，或可能成為異常用下