核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用綜述

1、核酸分子雜交技術(shù)與應(yīng)用綜述摘要 核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種嶄新的分子生物學(xué)技術(shù)。它是基于DNA分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，用特異性的核酸探針與待測(cè)樣品的DNA/RNA形成雜交分子的過(guò)程。分子雜交實(shí)驗(yàn)依據(jù)其形式的不同可以分為液相雜交、固相雜交、原位雜交，而固相雜交又可以分為菌落雜交、點(diǎn)/狹縫雜交、Southern印跡雜交和Northern印跡雜交。各類型雜交稻基本原理和步驟是基本相同的，只是選用的雜交原材料、點(diǎn)樣方法有所不同。關(guān)鍵字 核酸分子雜交 液相雜交 固相雜交 原位雜交 應(yīng)用 本文是對(duì)分子雜交技術(shù)的原理和類型分類及其應(yīng)用的一篇綜述。旨在了解各種雜交類型的應(yīng)用方向，即在生物、

2、醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。一、 核酸分子雜交原理DNA分子是由兩條單鏈形成的雙股螺旋結(jié)構(gòu)，維系這一結(jié)構(gòu)的力是兩條單鏈堿基氫鍵和同一單鏈上相鄰堿基間的范德華力。在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成無(wú)規(guī)則線團(tuán)，DNA分子成為單鏈，這一過(guò)程稱作變性或融解。加熱、改變DNA融解的pH值，或有機(jī)溶劑等理化因素，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在溫度升高引起的DNA變性過(guò)程中，DNA的變性會(huì)在一個(gè)很狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，這一溫度范圍的重點(diǎn)被稱作融解溫度Tm。Tm值得大小取決于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其Tm值越高。因?yàn)镚-C堿基之間有

3、三個(gè)氫鍵，而A-T堿基之間只有兩個(gè)氫鍵。變性DNA只要消除變性條件，具有堿基互補(bǔ)的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈，這一過(guò)程稱作復(fù)性。根據(jù)這一原理，將一種核酸單鏈標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，可以形成異源核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱作雜交（hybridization）。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來(lái)源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)序列就可以形成雜交體。二、 核酸分子雜交類型（一） 固相雜交固相雜交是把欲檢測(cè)的核酸樣品先結(jié)合到某種固相支持物上，再與溶解于溶液中的雜家探針進(jìn)行反應(yīng)，雜交結(jié)果可用儀器進(jìn)行檢測(cè)，但大多數(shù)情況下直接進(jìn)行放射自顯影，然后

4、根據(jù)自顯影圖譜分析雜交結(jié)果。1、 菌落雜交用于重組細(xì)菌克隆篩選的固相雜交，稱作菌落雜交。主要步驟包括菌落平板培養(yǎng)、濾膜滅菌后放到細(xì)菌平板上，使菌落粘附到濾膜上，將濾膜放到經(jīng)適當(dāng)溶液飽和度吸水紙上，菌斑溶解產(chǎn)生單鏈的DNA，固定DNA用32P標(biāo)記的單鏈探針與菌落DNA進(jìn)行雜交。雜交后，洗脫未結(jié)合的探針，將濾膜暴露于X線膠片進(jìn)行放射自顯影。將自顯影膠片、濾膜、培養(yǎng)平板比較就可以確定陽(yáng)性菌落。2、 Southern雜交Southern雜交是從環(huán)境樣品中提取細(xì)菌總DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割，經(jīng)凝膠電泳分離后，將凝膠中的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后對(duì)該膜進(jìn)行探針檢測(cè)的方法。只有含有

5、靶DNA序列的DNA分子才能與特定的核酸探針進(jìn)行雜交。Southern雜交主要用于研究某些細(xì)菌多態(tài)性變化規(guī)律。3、 Northern印記雜交Northern印記雜交和Southern印記雜交的過(guò)程基本相同，區(qū)別在于靶核酸是RNA而非DNA。RNA在電泳前已經(jīng)變性，進(jìn)一步經(jīng)歷變性凝膠電泳分離后，不再進(jìn)行變性處理。在Northern雜交中所使用的探針常常是克隆的基因。（二） 液相雜交液相雜交是一種研究最早且操作簡(jiǎn)便的雜交類型。液相雜交的反應(yīng)原理和反應(yīng)條件與固相雜交基本相同，僅僅是將待檢測(cè)的核酸樣品和雜交探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，然后利用羥磷灰石柱選擇性結(jié)合單鏈或雙鏈核酸的性質(zhì)分離雜化雙鏈和未參

6、加反應(yīng)的探針，用儀器計(jì)數(shù)并通過(guò)計(jì)數(shù)分析雜交結(jié)果，或者利用核酸分子的減色性（260nm處吸光度的降低與雙鏈形成去的多少成正比）分析雜交的結(jié)果。（三） 原位雜交原位雜交是應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中的核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位或基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)。其中在此技術(shù)上發(fā)展的熒光原位雜交（FISH）技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、安全、無(wú)污染、探針?lè)€(wěn)定、快速、簡(jiǎn)便、直觀、可靠、靈敏度高、信號(hào)強(qiáng)、背景低等，在診斷生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和病理學(xué)研究上均得到廣泛的應(yīng)用。三、 核酸分子雜交技術(shù)應(yīng)用（1） Southern印記雜交1、 單基因遺

7、傳病的基因診斷：早在1978年，簡(jiǎn)悅威等醫(yī)學(xué)家在鐮狀細(xì)胞貧血癥的基因診斷中就采用過(guò)Southern雜交的方法，取得了基因診斷的突破。2、 基因點(diǎn)突變的檢測(cè)：例如ATP敏感性鉀離子通道的亞單位內(nèi)向整流鉀通道基因A635G突變的檢測(cè)（2） Northern印記雜交Northern印記技術(shù)多用來(lái)檢查基因組中某個(gè)特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平。目前，Northern印記技術(shù)仍然被認(rèn)為是檢測(cè)基因表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)。（3） 液相雜交以液相雜交技術(shù)為基本工作原理設(shè)計(jì)的多功能懸浮點(diǎn)陣儀是液態(tài)芯片技術(shù)應(yīng)用的典范。這一技術(shù)平臺(tái)已被應(yīng)用于遺傳突變的分子診斷，如出生缺陷干預(yù)工程中的Downs綜合征、珠蛋白合成

8、障礙性貧血、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷的基因診斷，也已被用于SNPs分析、感染性疾病的鑒別診斷、藥物敏感性和親子鑒定。此外，還可以應(yīng)用于基因表達(dá)譜的分析，從而進(jìn)行腫瘤性疾病如血液病、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌和結(jié)腸癌的分子病理學(xué)研究。（4） 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)1、 細(xì)胞遺傳學(xué)分析產(chǎn)前診斷：在新生兒的先天性疾病中，染色體的數(shù)目異常要占很大的一部分，其中以染色體X、Y、13、18和21數(shù)量的異常最為多見(jiàn)。利用FISH技術(shù)的優(yōu)勢(shì)還可以用于產(chǎn)前診斷中的羊水細(xì)胞核型分析。常規(guī)的染色體型分析技術(shù)需要對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間較長(zhǎng)。FISH技術(shù)可以在少量的羊水細(xì)胞涂片上進(jìn)行異常染色體的數(shù)目分析

9、，不需要羊水細(xì)胞的培養(yǎng)，記得地縮短了病人等待的時(shí)間。生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用：采用FISH技術(shù)可對(duì)一個(gè)卵裂球的染色體進(jìn)行檢測(cè)，排除存在染色體異常的胚胎，提高胚胎種植成功率。另一方面，對(duì)精子染色體的研究已經(jīng)成為男性不育者精子檢測(cè)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。血液疾病中染色體易位的檢測(cè)：在化療后緩解的慢性粒細(xì)胞性白血病病人的標(biāo)本中，采用FISH技術(shù)極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細(xì)胞，確定微小殘留病灶。FISH檢測(cè)的結(jié)果對(duì)白血病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)提供了有力的依據(jù)，也為白血病機(jī)制的研究提供了線索。2、病原學(xué)檢測(cè)：采用FISH技術(shù)還可以快速鑒定血培養(yǎng)中的微生物、送檢樣本中的病毒等，采用診斷微生物DNA或RNA的熒光標(biāo)記探針可以直接快速地檢測(cè)出微生物病原體核酸，檢測(cè)靈敏度較高。3、比較基因組雜交4、基因圖譜繪制5、診斷微生物菌落結(jié)構(gòu)與群落動(dòng)態(tài)6、監(jiān)測(cè)微生物的原位生理學(xué)7、FISH技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)定量化檢測(cè)微生物四、 展望盡管核酸分子雜交技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但其在臨床實(shí)用中仍存在不少問(wèn)題，必須提高檢測(cè)單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質(zhì)代替放射性同位素標(biāo)記探針以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和縮短雜交時(shí)間，這樣，就需要在以下三方面著手研