質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌材料試劑：胰化蛋白胨，酵母提取物，瓊脂，NaCl，NaOH（調(diào)pH），氨芐青霉素，卡那霉素，質(zhì)粒提取試劑盒儀器：高壓滅菌鍋，42恒溫水浴鍋，恒溫?fù)u床（37,225rpm），無(wú)菌培養(yǎng)板，消毒1.5ml離心管，消毒槍頭，無(wú)菌操作臺(tái)實(shí)驗(yàn)步驟：1. LB培養(yǎng)基的配制：在950 ml去離子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解.用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.0.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min. 固態(tài)培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基及倒板 ： （1）.配制：100mlLB培養(yǎng)基加入1.5g瓊脂粉 （2）.抗生素的加入：

2、高壓滅菌后，將融化的LB固體培養(yǎng)基置與55的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到55時(shí)（手可觸摸）加入氨芐抗生素（終濃度為50g/ml），以免溫度過(guò)高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。 （3）.倒板：一般10ml倒1個(gè)板子。培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開(kāi)蓋子，在紫外下照10-15分鐘。 （4）.保存：用封口膠封邊，并倒置放于4保存，一個(gè)月內(nèi)使用。 2. 從-70冰箱中取200l感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。3. 加入質(zhì)粒DNA溶液（含量不超過(guò)50ng，體積不超過(guò)10l），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后。4. 42水浴中熱擊45s/90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。5. 向管中加入1ml LB

3、液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr ）。6. 將上述菌液搖勻后取100l 涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)16-24小時(shí)。同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照：對(duì)照組1： 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。對(duì)照組2： 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時(shí)只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。大腸桿菌的擴(kuò)增1. 從LB平板上挑取新活化的單個(gè)菌落，接種于3-5ml

4、 LB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將該菌懸液以1：100-1：50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至OD600 0.5左右。2. 取上述培養(yǎng)液置于冰中10min，之后轉(zhuǎn)移到已滅菌的50ml離心管中再于冰上放置5min3. 于4離心，2700rmp，10min，棄上清，收集細(xì)菌4. 質(zhì)粒的提取準(zhǔn)備大腸桿菌質(zhì)粒提取盒和擴(kuò)增的帶質(zhì)粒大腸桿菌培養(yǎng)液5. 質(zhì)粒鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株材料 細(xì)胞株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（Lipofecta

5、mine TM2000） 實(shí)驗(yàn)步驟.準(zhǔn)備細(xì)胞： 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前 24 h，在 500 µL無(wú)雙抗完全培養(yǎng)基中接種0.5-2×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為80 - 90% 。 ( 注：鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長(zhǎng)。) II 對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按下面的方法準(zhǔn)備： （1）用50 µL Opti-MEM稀釋0.8 µg質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸3 - 5 次混勻，室溫下靜置5 min。 （2）輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50 µL Opti-MEM 稀釋2.0 µL Lipofectamine TM2000，輕輕吹吸3 - 5 次

6、混勻，室溫下靜置5 min。 （3）混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 20 min。注: 轉(zhuǎn)染復(fù)合物一旦形成，應(yīng)立即加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。 （4）轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100 µL/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。 （5）將細(xì)胞板置于37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右，進(jìn)行換液，換成含10%血清的普通培養(yǎng)基，在37，5CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h左右。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選（各種細(xì)胞用什么抗生素篩選呢）從37，5CO2孵育箱中取出培養(yǎng)皿，棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2遍，胰蛋白酶消化，接種1/2的細(xì)胞到100 mm培養(yǎng)皿中，加入含500 µg/ml G418的新鮮培養(yǎng)基，每2-3天更換一次新的篩選培養(yǎng)基，每天觀察細(xì)胞的死亡情況。當(dāng)正常細(xì)胞完全死亡后，換用新的不含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞達(dá)到60%匯合率時(shí)再用含500 µg/ml G418的培養(yǎng)基篩選一次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%以上匯合率時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)（轉(zhuǎn)染后1