大孔樹脂柱層析法純化金櫻子總黃酮的初步研究

1、中藥材JournalofChineseMedicinalMaterials第30卷第8期2007年8月1013大孔樹脂柱層析法純化金櫻子總黃酮的初步研究陳乃富,陳科,張莉,楊懷志(皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系,安徽六安237012)摘要目的:研究AB28大孔樹脂純化金櫻子總黃酮的工藝條件。方法:用70%乙醇提取金櫻子中黃酮類化合物,得到粗黃酮粉,利用分光光度法測定樣品中的黃酮含量。以AB28型大孔吸附樹脂對(duì)金櫻子黃酮提取液的吸附為研究對(duì)象,對(duì)影響AB28型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸金櫻子黃酮的各種因素進(jìn)行了初步研究。結(jié)果:其最佳工藝為樣液濃度013mg/ml,上樣量為120mg、以1ml/min吸附速

2、率進(jìn)行吸附,5BV的70%乙醇、1ml/min的流速進(jìn)行洗脫效果最佳。粗黃酮粉的黃酮含量為2512%,經(jīng)AB28型大孔吸附樹脂純化后的金櫻子精黃酮粉中黃酮的含量達(dá)4212%。結(jié)論:AB28大孔吸附樹脂對(duì)金櫻子黃酮有一定的純化效果。關(guān)鍵詞金櫻子;AB28大孔吸附樹脂;純化;黃酮中圖分類號(hào):R28412文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100124454()08210132StudyonPurificationofTotalitawithMnLi,YANGHuai2zhi(ifeScience,WestofAnhuiUniversity,Liuan237012,China)Abstractthetechno

3、logicconditionsofpurifyingtotalRosalaevigatabyAB28pocket1Methods:ExtractingflavonoidsfromRosawith70%alcohol,thethickflavonoidpowderwereobtainedandthecontentofpureflavonoidsinitcouldbedeterminatedusingspectrophotometry1TakingtheadsorptionoftheAB28pockettoRosaflavonoidsastheresearchobject,thefactorsth

4、ataffectedtheAB28resinstaticabsorptionanddesorptionwerestudiedpreliminarily1Results:Theresultshowedthattheeffectwasperfectwhentheflavononidconcentrationintheliquidwas013mg/ml,theloadingamountwas120mgwiththeadsorption2power1ml/min;Andthevolumeof70%alcoholwaseluant5BVwithdesorption2power1ml/min1Thepur

5、eflavonoidcontentinthickflavonoidpowderwas2512%anditreached4212%afterbeingpurifiedbytheAB28pocketadsorptionresin1Conclusion:ItprovedAB28pocketadsorptionresinhaveabettereffectonpurificationoftheflavononidsofRosalaevigata1KeywordsRosalaevigata;AB28macroporousadsorptionresin;Purification;Flavonoids金櫻子R

6、osalaevigataMichx(L1),俗稱糖罐子、刺頭、油櫻,是薔薇科薔薇屬的傳統(tǒng)藥食兩用野生植物,常綠灌木,在我國的華南、華中、華東、西南等地都有很廣泛的分布,安徽省主要產(chǎn)于皖南山區(qū)、大別山區(qū)及江淮丘陵等地14血脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性,是自然界藥用植物中主要活性成分之一6。710有關(guān)研究結(jié)果表明,AB28型大孔吸附樹脂對(duì)黃酮類物質(zhì)有較好的吸附和解吸效果。本實(shí)驗(yàn)開展了AB28型大孔吸附樹脂柱層析法純化金櫻子總黃酮的工藝條件研究,為金櫻子黃酮的純化提供參考依據(jù)。1材料與方法111試驗(yàn)材料金櫻子果實(shí)采自金寨縣響洪甸。112儀器與試劑11211儀器:HH24數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有。其

7、果實(shí)有固精、澀腸、縮尿、止瀉等功能,主治滑精、遺尿、尿頻、高血壓、神經(jīng)性頭痛、久咳、慢性腎炎、抗壞血酸缺乏癥、皮膚病、腫瘤、神經(jīng)衰弱、子宮脫垂、燒灼傷等,并對(duì)阻止實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈樣硬化有一定的功效5。表明金櫻子黃酮類化合物主要是黃酮文獻(xiàn)5和黃酮醇兩類;金櫻子黃酮類化合物有顯著的阻斷亞油酸過氧化作用,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,且在一定濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)正向量效關(guān)系。金櫻子果實(shí)中黃酮含量很高,表明這一野生植物資源具有很大的開發(fā)價(jià)值。黃酮類化合物具有清除氧自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)限公司),TGL2200M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司),TU21201紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器設(shè)備有限公

8、司),RE2520旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海浦滬儀器廠),SHB2循環(huán)水式多用真空泵,KQ2500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),SHANGPINGFA1004電子天平(上海作者簡介:陳乃富(19622),男,教授,研究方向?yàn)橹参锷c植物資源開發(fā)與利用,Tel:(0564)3305073。1014中藥材JournalofChineseMedicinalMaterials第30卷第8期2007年8月精科天平),玻璃儀器氣流烘干器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(40目,浙江省上虞縣紗篩廠),層析柱(15×200mm),索式提取器。11212試劑:AB28型大孔吸附樹脂(天津市

9、光復(fù)精細(xì)化工研究所),無水乙醇(徐州試劑二廠),乙醚(開封化學(xué)試劑總廠),石油醚(上海試劑一廠綜合經(jīng)營公司),蘆丁(Rutin,上?；瘜W(xué)試劑公司),鹽酸(合肥醫(yī)藥站化玻部),亞硝酸鈉(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司),硝酸鋁(上?？撇?xì)化學(xué)品公司AR)。113黃酮類化合物的提取11311樣品處理;稱取200g左右干金櫻子果實(shí),其中m0:上樣黃酮的質(zhì)量;m1:吸附后流出液黃酮的質(zhì)量;m2:解吸后流出液黃酮的質(zhì)量。2結(jié)果與分析211黃酮粉的黃酮含量從粗黃酮粉中精確稱取30mg,用70%乙醇定容至50ml,取1ml采用亞硝酸鈉2硝酸鋁比色法,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為參照測得濃度為C1,則粗黃酮粉中黃酮含量為:(

10、10×C1)/(30/50)×100%,重復(fù)三次取平均值。由此算法算得金櫻子粗黃酮粉中黃酮含量為2512%。212AB28型大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果211:10mg/ml、013mg/ml,l的粗黃酮溶液各50ml,離心1ml測濃度C后上柱,吸附后各用3倍床體積(即3BV)的水洗柱,收集所有吸附及洗柱流出液,測定其中黃酮濃度C1,計(jì)算吸附的黃酮量及吸附率見圖1。除去花萼,剖開并除去種子,取果肉置烘箱中103烘干,然后在研缽中研成粉末,過40目篩后收集粉末并烘干至恒重,在干燥器中冷卻備用。11312脫脂5、6:采用,為脫脂劑于45,取出樣品。11313浸提:在90

11、水浴加熱的條件下冷凝回流浸提金櫻子黃酮,共浸提12次,每次浸提固液比為14,合并12次浸提液,加入等體積的石油醚充分振蕩進(jìn)行二次脫脂,棄去石油醚層,收集脫脂處理后的粗黃酮液定容至1000ml。取一定體積粗黃酮液,在90水浴加熱條件下,將粗黃酮液濃縮成漿狀,再于103烘箱中烘干,得粗黃酮粉。1010114黃酮含量的測定按文獻(xiàn)采用分光光度法以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)在510nm處測吸光度,此方法又稱亞硝酸鈉2硝酸鋁比色法,利用以上相同方法測定樣品中黃酮的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:A=111997C-010045,相關(guān)系數(shù)r=019989。A:吸光度,C:黃酮濃度(mg/ml)用40目篩在水中篩選出大小合適、分

12、布均勻的樹脂,先用體積分115大孔吸附樹脂的預(yù)處理11、12圖1樣液濃度對(duì)吸附率的影響由圖1可知,樣液濃度為013mg/ml時(shí)吸附率較高,可達(dá)到9015%,黃酮液濃度過大或過小都影響吸附效果,所以樣液濃度以013mg/ml上柱為好。21212不同吸附速率的考查:取一定質(zhì)量的粗黃酮粉用水定容到1000ml離心后取1ml測濃度C,然后取100ml配制成013mg/ml的樣液5份,分別上柱并以不同的吸附速率吸附,吸附后用3BV的水洗柱,收集所有吸附時(shí)及洗柱流出液,測其中黃酮濃度C1,計(jì)算吸附的黃酮量及吸附率。數(shù)95%乙醇充分浸泡24h裝柱,然后用95%乙醇洗至洗出液加適量水無白色渾濁,用去離子水洗至

13、無醇味后加入4倍體積的5%HCl浸泡3h,用去離子水洗至中性,再加入4倍體積的5%NaOH浸泡3h,最后用去離子水洗至中性備用。116AB28型大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)室溫下AB28型大孔樹脂的吸附率和解吸率,按以下公式計(jì)算:吸附率=(12m1/m0)×100%解吸率=m2/(m02m1)×100%1114圖2不同吸附速率對(duì)吸附率的影響中藥材JournalofChineseMedicinalMaterials第30卷第8期2007年8月1015由圖2可知,015ml/min吸附率雖然略高于110ml/min的吸附率,但由于015的速率較慢,用時(shí)較長,速率在115以上

14、時(shí)雖用時(shí)較少,但吸附率較低,綜合以上因素考慮一般選用110ml/min吸附較好。21213洗脫劑濃度考查:取一定質(zhì)量的粗黃酮粉2121570%乙醇的洗脫用量考查:取一定質(zhì)量的粗黃酮粉用水定容到1000ml離心后取1ml測濃度C,后各取100ml配制成013mg/ml的樣液5份,分別上柱以110ml/min的速率吸附后用3BV的水洗柱,再分別以2BV,3BV,4BV,5BV,6BV70%乙醇的洗脫液進(jìn)行解吸附,最后測解吸后流出液的濃度C1,計(jì)算解吸率如下圖5所示。用水定容到500ml離心后取1ml測濃度C,后各取50ml配制成013mg/ml的樣液5份,分別上柱以1ml/min的速率吸附后用3B

15、V的水洗柱,再用4BV的濃度分別為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液進(jìn)行解吸附,最后測解吸后流出液的濃度C1,計(jì)算解吸出的黃酮量及解吸率。圖5不同洗脫用量對(duì)解吸率的影響由圖5可知,2BV4BV的解吸率較低,而4BV,5BV,6BV解吸率較高且相差不大,但4BV處圖3洗脫劑濃度不同對(duì)解吸率的影響由圖3可知,70%的乙醇對(duì)黃酮的水溶液解吸的解吸附效果較好,其解吸率達(dá)8613%,因此一般選用70%的乙醇作解吸劑。2121470%乙醇的洗脫速率考查:取一定質(zhì)量的粗黃酮粉用水定容到1000ml離心后取1ml測濃度C,后各取100ml配制成013mg/ml的樣液5份,分別上柱以110ml/m

16、in的速率吸附后用3BV的水洗柱,再分別用70%乙醇以015ml/min,1ml/min,2ml/min,3ml/min,4ml/min洗脫速率進(jìn)行解吸附,最后測得吸后流出液的濃度C1,計(jì)算解吸率如下圖4所示。于臨界點(diǎn)又考慮到充分解吸和經(jīng)濟(jì)因素,一般選用4BV5BV的70%乙醇液解吸為宜。21216上樣量的考查:上柱AB28型大孔吸附樹脂10cm約為20g。取一定質(zhì)量的粗黃酮粉用水溶解后測黃酮濃度,并調(diào)整至黃酮濃度C=015mg/ml,分別取樣液量為120ml,160ml,200ml,240ml,280ml稀釋至013mg/ml的樣液上柱以1ml/min的速率吸附后用3BV的水洗柱,再取流出液

17、測濃度C1計(jì)算各柱的吸附率,所得結(jié)果如下圖6所示。圖6上樣量對(duì)吸附率的影響圖4乙醇的洗脫速率對(duì)解吸率的影響由圖6可知,20g大孔吸附樹脂對(duì)60mg到120mg黃酮吸附率較高,上樣量120mg以上時(shí)吸附率明顯下降,因此樹脂最大吸附量約為120mg黃酮,即換算成1g大孔吸附樹脂量大吸附量約為6mg黃酮,因此每克大孔吸附樹脂上樣量不宜超過6mg。213AB28型大孔吸附樹脂對(duì)金櫻子黃酮的純化效果取預(yù)處理好的大孔樹脂濕法裝柱(20cm×115cm)10cm高,按每克樹脂吸附6mg計(jì)算,稱取由圖4可知,乙醇的洗脫速率越快解吸率越低,015ml/min解吸率雖然略高于110ml/min的解吸率,

18、但由于015ml/min的速率較慢,用時(shí)較長,而當(dāng)速率大于1時(shí)解吸率有所下降,綜上考慮所以一般選用1ml/min解吸為好。1016中藥材JournalofChineseMedicinalMaterials第30卷第8期2007年8月一定量的粗黃酮粉用水溶解并調(diào)整其濃度為013mg/ml,然后加入上述層析柱中,控制流速1ml/min,待上樣液完全流盡后,先用3BV的去離子水洗柱,再用5BV70%的乙醇溶液洗脫至洗出液呈無色。收集洗脫液置于90水浴中濃縮至漿狀后,再至103烘干至恒重,得精黃酮粉。從中精確稱取1010mg定容至10ml,測定出精制黃酮粉中的黃酮含量為4212%,較未純化前的粗黃酮粉

19、的黃酮含量有所提高,表明AB28型大孔吸附樹脂對(duì)金櫻子黃酮有一定的純化效果。3小結(jié)AB28型大孔吸附樹脂對(duì)金櫻子黃酮具有一定技開發(fā),2000,(1):4524614丁小雯1金櫻子袋泡飲料的研制1食品工業(yè),2000,2:3423515陳乃富,張莉1金櫻子黃酮類化合物的初步研究1中國林副特產(chǎn),2005,(5):22416陳乃富1蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用1食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(11):6326617李劍君,李穩(wěn)宏,李多偉,等1葛根總黃酮中葛根素的分離研究1西北大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(4):311231418貝偉劍,彭文烈,羅杰1柿葉黃酮的大孔吸附樹脂分離提純富集1中成藥,20

20、05,(3):257226119盧錦花,胡小玲,岳紅,等1大孔吸附樹脂對(duì)銀杏葉黃酮1化學(xué)研究與應(yīng)用,2002,(2):1,的純化效果。黃酮液濃度在013mg/ml左右時(shí)大孔吸附樹脂對(duì)黃酮吸附率最佳可達(dá)9015%,70%的乙醇對(duì)金櫻子黃酮的解吸附有很好的效果,達(dá)90%左右,以每g樹脂上樣1l/m,0l/min的參考文獻(xiàn)1,2000,(2):212231,丁霄霖1大孔樹脂對(duì)玉米須類黃酮的吸附分離特性研究1食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(12):17221112金向群,劉永剛,隨志剛,等1D140大孔樹脂分離純化淫羊藿黃酮的研究1中成藥,2004,26(11):8722875113李劍君,李穩(wěn)宏,高

21、新,等1AB28型大孔吸附樹脂吸附葛根素過程的研究1西安交通大學(xué)學(xué)報(bào),2000,34(4):78281114崔堂兵,石漫瑩,郭勇,等1銀杏黃酮的提取與大孔樹1安徽植物志協(xié)會(huì)作組編1安徽植物志(第二卷)1北京:中國展望出版社,1990:4524612閔運(yùn)江,陳乃富,劉文中1保健野果金櫻子1植物雜志,1996,(2):913黃泉星,羅旌造1野生金櫻子果汁飲料的研制1林業(yè)科脂吸附研究1廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2002,21(4):26622701(2007-01-04收稿)秦香止瀉腸溶片提取、干燥工藝研究郭錦明,李慧,滕久祥,彭芝佩,何群,劉蓉(湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南長沙410007)摘要目的:優(yōu)選秦香止瀉腸溶片提取、干燥工藝條件。方法:以秦皮甲素,秦皮乙素含量為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo),采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)水提工藝條件進(jìn)行研究,并對(duì)水提濃縮液進(jìn)行干燥工藝研究。結(jié)果:水提最優(yōu)工藝條件是:不浸泡;提取次數(shù)2次;