人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定

1、上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)Vo.l29No.3Mar.2009JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)307文章編號:0258-5898(2009)03-0307-05論著人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定石倫剛,唐鄭雅,陸峻泓,曹誼林,張文杰(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院整復(fù)外科上海組織工程國家工程研究中心,上海200011)摘要:目的建立誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法,并鑒定細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法人胚胎干細(xì)胞在無血清條件下懸浮培養(yǎng)形成類胚體,10d后在含血清條件下使類胚體貼壁生長,56d后機(jī)械法剔除類胚體

2、中心區(qū)高密度重疊細(xì)胞,保留周邊鋪展細(xì)胞并傳代擴(kuò)增。觀察誘導(dǎo)分化與傳代擴(kuò)增后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表型分析。取第5代細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo),34周后運(yùn)用特殊染色及RTPCT技術(shù)檢測細(xì)胞成脂、成骨及成軟骨分化能力。結(jié)果誘導(dǎo)分化后細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的形態(tài),擴(kuò)增能力較強(qiáng),多次擴(kuò)增傳代后細(xì)胞形態(tài)和增殖能力無明顯改變。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)中胚層標(biāo)志波型蛋白(vimentin)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,細(xì)胞表達(dá)CD29、CD105、CD166等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。特殊染色及RTPCT檢測結(jié)果顯示,成脂誘導(dǎo)后多數(shù)細(xì)胞油紅染色陽性,脂蛋白酶和leptin表達(dá)增加

3、;成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞茜素紅染色陽性,堿性磷酸酶和Cbfa1表達(dá)增加;成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞型膠原染色陽性,型膠原和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論成功誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞分化。分化獲得的細(xì)胞增殖能力強(qiáng),表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志,并具有多向分化潛能。關(guān)鍵詞:人胚胎干細(xì)胞;間充質(zhì)干細(xì)胞;誘導(dǎo);分化中圖分類號:Q813文獻(xiàn)標(biāo)志碼:AInductionandidentificationofmesenchymalstemlikecellsfromhumanembryonicstemcellsSHILungang,TANGZhengya,LUJunhong,CAOYilin,ZHANGWe

4、njie(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,ShanghaiNationalTissueEngineeringCenter,TheNinthPeoplesHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011,China)Abstract:ObjectiveToestablishthemethodofinductionofmesenchymalstemlikecellsfromhumanembryonicstemcells(hESCs),andidentifyt

5、hecellbioactivities.MethodshESCswereculturedintheabsenceofserumfor10daystoformembryoidbodies,andweretransferredforadherentcultureinthepresenceofserum.Fivetosixdaysafteradherentculture,migratingcellswereselectivelyisolatedandexpanded.MorpholgyofhESCsderivedcellswasobserved,andcellsurfacemarkerswerean

6、alysedwithmimunofluorescentstainingandflowcytometry.Cellsofthefifthpassagewereobtainedforadipogenic,osteogenicandchondrogenicinduction,andspecificstainingandRTPCTwereemployedtoevaluatetheadipogenic,osteogenicandchondrogenicdifferentiationpotencies.ResultshESCsderivedcellsexhibitedsmiilarmorphologyas

7、bonemarrowmesenchymalstemcells(MSCs)andfavourableproliferationpotency,andwerestablyexpandedforpassages.Theexpressionofvmientin,CD29,CD105andCD166wasdetected.CellswerepositiveforOilRedOstaining,AlizarinRedstainingandmimunohistochemicalstainingafteradipogenic,IIcollagenandcartilageoligomericmatrixprot

8、ein(COMP)expressionwasincreased,potency,expressspecificmarkersofMSCsandpossessmultipotentdifferentiationpotentia.lKeywords:humanembryonicstemcells;mesenchymalstemcells;induction;differentiationosteogenicandchondrogenicrespectively.Conclusiondifferentiation,respectively,andlipoproteinlipaseandleptine

9、xpression,alkalinephosphataseandCbfa1expression,typeMesenchymalstemlikecellscanbeinducedanddifferentiatedfromhESC.Thecellsavailablebearfavorableproliferation干細(xì)胞研究能為細(xì)胞治療和組織工程技術(shù)提供可靠的種子細(xì)胞來源,成體干細(xì)胞因其具有多基金項(xiàng)目:Program,作者簡介:向分化潛能和可自體取得等優(yōu)勢,已成為研究的重點(diǎn),部分細(xì)胞已在臨床中得到應(yīng)用,如造血干細(xì)國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2005CB522705);國家自然科學(xué)基金

10、(30571925,30671051)(NationalBasicResearch973Program,2005CB522705;NationalNaturalScienceFoundationofChina,30571925,30671051)。石倫剛(1980-),男,碩士生;電子信箱:lungangsh。,eni308上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)Vo.l29胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等,尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞,因其具有向中胚層的脂肪、骨、軟骨、肌肉細(xì)胞分化,在骨、軟骨組織工程以及心肌梗死后的心肌修復(fù)治療中得以應(yīng)用1-32mmol/L谷氨酰胺,貼壁培養(yǎng),每2d換液1次,培養(yǎng)57d后機(jī)械法剔除中心高密度部分

11、細(xì)胞,保留周邊鋪展細(xì)胞并傳代擴(kuò)增。擴(kuò)增細(xì)胞每3d傳代1次。1.3細(xì)胞表型分析1.3.1免疫熒光染色:參照Chen等6。與成體干細(xì)胞相比,胚胎干細(xì)胞具有無限擴(kuò)增和向所有體細(xì)胞分化的能力,成為潛在的種子細(xì)胞來源。然而,免疫原性和致瘤性仍然是胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于臨床前必須解決的問題。免疫原性有望通過核移植技術(shù)或建立誘導(dǎo)性全能干細(xì)胞得以解決,而致瘤性問題則需通過誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向特定細(xì)胞分化并分離純化靶細(xì)胞來解決。胚胎干細(xì)胞通常在撤除抑制分化的因子后會(huì)發(fā)生自發(fā)分化,形成3個(gè)胚層的前體細(xì)胞4的方法操作。細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定后破膜處理,加兔抗人vimentin和羊抗人nestin抗體孵育過夜,用FITC標(biāo)

12、記的抗羊IgG(AlexaFluor555)和PE標(biāo)記的抗兔IgG(AlexaFluor555)顯色,熒光顯微鏡觀察。1.3.2流式細(xì)胞:參照Chen等6的方法操作。取第5代細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,加PE標(biāo)記的抗人CD13、CD29、CD34、CD105和CD166,生物素標(biāo)記的抗人CD31、HLAABC和HLADR,鼠抗人STRO1孵育20min;加PE標(biāo)記的鏈霉親和素或FITG標(biāo)記抗鼠IgM顯色,采用流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter)分析,每份樣本分析至少10000個(gè)細(xì)胞。1.4多向分化能力鑒定65。如何將特定方向的前體細(xì)胞從混合細(xì)胞群中分離是目前研究的難點(diǎn)。本研究采用分步分化、改變

13、生長條件和機(jī)械分離的方法,從人胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcells,hESCs)中誘導(dǎo)分化獲得一群具有類似成體間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞群,這群細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能。1材料與方法1.1主要試劑KnockoutDMEM培養(yǎng)液(Invitrogen);型膠原酶(Sigma);兔抗人vimentin、羊抗人nestin(SantaCruzBioscience);PE標(biāo)記的抗人CD13、CD29、CD34、CD105、CD166,鼠抗人STRO1(R&DBiosciences);PE標(biāo)記的鏈霉親和素(BDPharmingen);生物素標(biāo)記的抗人CD31、HLAABC、HL

14、ADR(eBioscienc);TRIzol(Invitrogen)。1.2誘導(dǎo)hESCs向類間充質(zhì)干細(xì)胞分化1.2.1hESCs體外培養(yǎng):hESCs(本中心分離保存)5TM1.4.1成脂肪分化和鑒定:誘導(dǎo)分化:取210個(gè)第5代細(xì)胞,在6孔板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2d,待細(xì)胞融合達(dá)80%后,添加高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、0.5mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、1mol/L地塞米松、10mol/L胰島素和200mol/L消炎痛)誘導(dǎo),每3天換液1次。以添加普通培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組。鑒定:成脂肪誘導(dǎo)3周后,細(xì)胞油紅O染色觀察;運(yùn)用RTPCR檢測細(xì)胞脂蛋白酶(lipoprot

15、einlipase,LPL)和leptin表達(dá)。TRIzol抽提總RNA,取2gRNA用RT試劑(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR試劑擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠顯色后凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。RTPCR引物序列及反應(yīng)條件詳見表1。1.4.2成骨分化和鑒定:誘導(dǎo)分化:取210個(gè)第5代細(xì)胞,在6孔板培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2d,待細(xì)胞融合達(dá)80%后,添加高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、10mg/L維生素C、2.16g/L-磷酸甘油和40ng/mL地塞米松)誘導(dǎo),每3d換液1次。以添加普通培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組。鑒定:誘導(dǎo)4周后,細(xì)胞茜素紅染色觀察;RTP

16、CR(方法同1.4.1)檢測細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbf1表達(dá)。1.4.3成軟骨分化和鑒定:誘導(dǎo)分化:取21055在胎鼠成纖維細(xì)胞鋪盤的培養(yǎng)皿中傳代,57d傳代1次。培養(yǎng)液為含20%knockout替代血清(Invitrogen)、1%非必須氨基酸(Sigma)、1mmol/L谷氨酰胺(Sigma)、0.1mmol/L巰基乙醇(Sigma)和4ng/mL重組人堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)(R&DSystem)的knockoutDMEM培養(yǎng)液。1.2.2hESCs誘導(dǎo)分化:

17、用1mg/mL型膠原酶(Sigma)消化hESCs克隆,機(jī)械法分割成約50個(gè)細(xì)胞/團(tuán)的小塊,在細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng),培養(yǎng)液為去除bFGF的hESCs傳代培養(yǎng)液,分化形成擬胚體(embryoidbodies,EBs)。取第10天的EBs,將其轉(zhuǎn)移到0.1%明膠(Sigma)鋪盤的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)液為高糖(,No.1石倫剛,等:人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定309合達(dá)80%后,添加高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、10ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子-1、50ng/mL胰島素生長因-1和40ng/mL地塞米松)誘導(dǎo),每3天換液1次。以添加普通培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組。鑒定

18、:誘導(dǎo)3周后,細(xì)胞行型膠原(typecollagen,Col)免疫組化染色和RTPCR(方法同1.4.1)檢測型膠原和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilageoligomericmatrixprotein,COMP)表達(dá)。表1RTPCR引物序列和反應(yīng)條件Tab1PrimersequencesandreactionconditonsforRTPCRGeneLPLLeptinCbf1AKPCOMPColactinPrimersequence5CTACAGAACAAAGAACGGC35TCTCAAAGGACAAAACAGC35AGACCACATCCACACACG35GCTCTTGCTCAGATGAACC

19、C35ACTGGGCCCTTTTTCAGA35TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA35AGCTTCAGAAGCTCAACACCA35ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC35GTCACGCTCACCGACTTCAGG35GCCAATACGTTTGCTCCATCT35GCGAGACTTGCGTCTACCC35ATTGGAGCCCTGGATGAGC35ATCATGTTTGAGACCTTCAA35CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3Cycle(n)31313131352929-35Annealingtemperature()58635653566053-60Product

20、size(bp)2532363174542922933182結(jié)果2.1hESCs來源細(xì)胞的分化和擴(kuò)增hESC在去除加速,每隔3d細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增大約45倍,傳7代時(shí)細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增約2000倍,細(xì)胞形態(tài)呈梭形(圖1D),與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)相似胞增殖曲線見圖2。2.2細(xì)胞表型分析大多數(shù)分化細(xì)胞表達(dá)中胚層標(biāo)志波型蛋白(vimentin),而不表達(dá)外胚層標(biāo)志巢蛋白(nestin)(圖3)。擴(kuò)增細(xì)胞表達(dá)CD29、CD105、CD166、CD13、HLAABC、CD31和STRO1,而不表達(dá)CD34和HLADR(圖4)。2.3多向分化能力鑒定2.3.1成脂肪細(xì)胞分化:成脂誘導(dǎo)后3周后,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴,油紅

21、O染色后約有60%的細(xì)胞呈陽性,而對照組呈弱陽性;RTPCR顯示誘導(dǎo)組LPL和leptin表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)(圖5)。7。代表性細(xì)了bFGF的無血清條件下懸浮培養(yǎng)10d,形成中空的球形EBs(圖1A),接著將EBs接種到明膠鋪盤的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng),在含有胎牛血清的條件下培養(yǎng)3d后,可見細(xì)胞從EBs周邊向外鋪展,呈鋪路石樣貼壁生長,56d時(shí)貼壁細(xì)胞明顯增多,但EBs中心區(qū)域仍有緊密重疊的細(xì)胞(圖1B),此時(shí)將中心區(qū)域密集重疊的細(xì)胞用機(jī)械法挑除,將周邊剩余的鋪路石樣細(xì)胞用胰蛋白酶消化后經(jīng)濾膜過濾,收集單細(xì)胞,這些細(xì)胞可在含血清的普通培養(yǎng)液中貼壁生長。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長緩慢,為梭形并呈克隆樣生長(

22、圖1C),1014d可達(dá)融合。此后細(xì)胞增殖圖1hESCs來源類間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)Fig1IsolationandcultureofhESCderivedmesenchymalstemlikecellsA:day10EBs;B:adherentcultureofEBsatday6;C:primarycultureofhESCderivedmesenchymalstemlikecells;D:hESCderivedmesenchymalstemlikecellsatpassage7.ScaleBar:40m310上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)Vo.l292.3.2成骨細(xì)胞分化:成骨誘導(dǎo)4周后,細(xì)胞

23、內(nèi)可見鈣鹽沉積,茜素紅染色約有40%的細(xì)胞呈陽性,而對照組染色呈微弱陽性;RTPCR顯示誘導(dǎo)組AKP和Cbf1表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)(圖6)。2.3.3成軟骨細(xì)胞分化:誘導(dǎo)2周時(shí)見部分細(xì)胞聚集成團(tuán),誘導(dǎo)3周后免疫組化染色顯示聚團(tuán)的細(xì)胞型膠原染色呈陽性,對照組中偶爾見聚團(tuán)細(xì)胞,型膠原染色呈弱陽性;RTPCR顯示型膠原和COMP表達(dá)在誘導(dǎo)后均增高(圖7)。3討論胚胎干細(xì)胞注射入囊胚后可以參與個(gè)體發(fā)育,向包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有體細(xì)胞分化,如何在體外實(shí)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的定向分化是干細(xì)胞研究的難點(diǎn)。迄今為止還沒有一種方法能誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞只向單一細(xì)胞類型分化,為了獲得特定類型的分化細(xì)胞,目前通常采用分步誘導(dǎo)的方

24、法8。首先在懸浮培養(yǎng)中使胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化形成類胚體,其中包含3個(gè)胚層的前體細(xì)胞,然后通過改變培養(yǎng)條件,如,No.1石倫剛,等:人胚胎干細(xì)胞向類間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定311胞選擇性分化增殖,最終獲得目的細(xì)胞。這一誘導(dǎo)分化模式也符合個(gè)體發(fā)育的規(guī)律,因?yàn)?個(gè)胚層的發(fā)育形成是密不可分的,只有在形成了各個(gè)胚層前體細(xì)胞的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)一步向特定細(xì)胞群分化。在hESCs分化形成類胚體的過程中不添加任何生長因子,分化一定時(shí)間后通常就能在基因水平檢測到類胚體中3個(gè)胚層細(xì)胞分化的表達(dá),由此進(jìn)一步分化已成功獲得了血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島細(xì)胞等成熟細(xì)胞9分化獲得的類間充質(zhì)干細(xì)胞的另一大特

25、點(diǎn)是細(xì)胞增殖能力強(qiáng),而長期傳代(20代)后的細(xì)胞是否仍保持多向分化能力正在進(jìn)一步確認(rèn)?？傊?本研究建立了一種簡便可靠的誘導(dǎo)hESCs向類間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法,細(xì)胞具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特性與分化能力,它不僅能夠作為研究組織早期發(fā)育的工具,也有望成為細(xì)胞治療或組織工程的種子細(xì)胞來源。參考文獻(xiàn):1ZhouG,LiuW,CuiL,eta1.RepairofporcinearticularosteochondraldefectsinnonweightbearingareaswithautologousbonemarrowstromalcellsJ.TissueEng,2006,12(11):3

26、209-3221.2ZhuL,LiuW,CuiL,eta1.TissueengineeredbonerepairofgoatfemurdefectswithosteogenicallyinducedbonemarrowstromalcellsJ.TissueEng,2006,12(3):423-433.3ChenSL,FangWW,YeF,eta1.Effectonleftventricularfunctionofintracoronarytransplantationofautologousbonemarrowmesenchymalstemcellinpatientswithacutemyo

27、cardialinfarctionJ.AmJCardio,l2004,94(1):92-95.4SmithAG.Embryoderivedstemcells:ofmiceandmenJ.AnnuRevCellDevBio,l2001,17:435-462.5WuCF,TsungHC,ZhangWJ,eta1.ImprovedcryopreservationofhumanembryonicstemcellswithtrehaloseJ.ReprodBiomedOnline,2005,11(6):733-739.6ChenFG,ZhangWJ,BiD,eta1.Clonalanalysisofne

28、stin(-)vimentin(+)multipotentfibroblastsisolatedfromhumandermisJ.JCellSc,i2007,120(16):2875-2883.7WagnerW,WeinF,SeckingerA,eta1.Comparativecharacteristicsofmesenchymalstemcellsfromhumanbonemarrow,adiposetissue,andumbilicalcordbloodJ.ExpHemato,l2005,33(11):1402-1416.8徐潔,叢笑倩,姚鑫.維生素A酸和雙丁酰環(huán)腺苷單磷酸對小鼠胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化J.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),1991,24(4):353-367.9RolletschekA,BlyszczukP,WobusAM.Embry