大段同種異體骨移植復(fù)合BMP2和TGF撥2對兔橈骨中段骨缺損愈合的影響

1、大段同種異體骨移植復(fù)合BMP2和TGF?撥?2對兔橈骨中段骨缺損愈合的影響【摘要】 目的探討外源性TGF?撥?2和BMP2復(fù)合同種異體骨對骨缺損愈合的作用。方法用兔橈骨骨缺損模型，在骨缺損局部單獨或聯(lián)合應(yīng)用TGF?撥?2和BMP2與同種異體骨復(fù)合，A組：同種異體骨與BMP2復(fù)合；B組（對照組）：自體骨；C組：同種異體骨與TGF?撥?2復(fù)合；D組：同種異體骨與TGF?撥?2、BMP2復(fù)合；通過不同時間X線片、生物力學(xué)、骨密度和骨痂鈣含量的檢測對骨缺損愈合情況進(jìn)行評估。結(jié)果B組的骨痂鈣含量、骨缺損愈合情況和愈合后的力學(xué)強度明顯優(yōu)于A、C、D組（P0.01），D組優(yōu)于A、C組（P0.05），C組優(yōu)于

2、A組（P0.01）。結(jié)論TGF?撥?2和BMP2在骨缺損愈合過程中均發(fā)揮了重要的作用。在兔骨缺損周圍局部應(yīng)用外源性TGF?撥?2和BMP2與同種異體骨復(fù)合，可明顯促進(jìn)骨缺損愈合，使骨痂量增加，增強骨折愈合后的力學(xué)強度。并且在骨折愈合時間上接近自體骨移植骨折愈合的時間，從而在臨床上縮短了需要大段植骨患者治療時間，減輕了患者痛苦。單用TGF?撥?2的作用強于BMP2。它們聯(lián)合應(yīng)用時，這種作用進(jìn)一步增強，在促進(jìn)骨缺損愈合方面具有協(xié)同作用。同時也為異體骨復(fù)合何種因子及因子的劑量提供可靠的參考指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】 同種異體骨； 轉(zhuǎn)化生長因子2； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白?2； 移植同種異體骨是僅次于自體骨的骨移植替

3、代材料，它不僅具有骨傳導(dǎo)作用，同時還具有一定的骨誘導(dǎo)能力1。轉(zhuǎn)化生長因子2（transforming growth factor?beta 2，TGF?撥?2）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是骨形成與修復(fù)過程中重要的細(xì)胞因子24。單純應(yīng)用外源性BMP2和TGF?撥?2促進(jìn)骨愈合的報道較多，但將外源性BMP2和TGF?撥?2復(fù)合用于骨折治療的報道較少，而與同種異體骨復(fù)合則未見相關(guān)報道。同時外源性TGF?撥?2和BMP2對骨愈合相互作用的關(guān)系目前尚不很清楚，其與同種異體骨的兼容與否尚待進(jìn)一步探討。本實驗是將同種異體骨移植與細(xì)胞生長因子復(fù)合起

4、來，充分發(fā)揮BMP2和TGF?撥?2的治療作用和同種異體骨支架的基床及引導(dǎo)作用，同時也為今后的研究工作提供參考。 1 材料與方法 1.1 同種異體骨的制備，參照文獻(xiàn)5的方法。1.2 BMP2和TGF?撥?2緩釋微粒，均購于美國Cytolab公司。 1.3 動物 新西蘭大白兔，雌雄各半，兔齡67個月，骨成熟，體重2.53 kg，由山西省農(nóng)科院畜牧研究所試驗兔場提供。 1.4 方法 1.4.1 實驗分組 48只兔，隨機分為同種異體骨+BMP2 、同種異體骨+TGF?撥?2、同種異體骨+BMP2+TGF?撥?2、自體骨（對照組）4組，每組12只，各組的性別和重量可比。 1.4.2 動物實驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>

5、 3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉，無菌條件下做雙前肢中段前外側(cè)縱行切口約20 mm，暴露橈骨，在小骨膜剝離器保護(hù)下用口腔渦輪轉(zhuǎn)于橈骨中段橫行鋸斷，切除骨段（連同骨膜）10 mm，清洗創(chuàng)面，按表1植入各種材料，逐層縫合筋膜和皮膚，分籠飼養(yǎng)。術(shù)后3 d 40萬U青霉素肌肉注射，1次/d。術(shù)后4、8、10、12周，ABCD組各隨機選擇3只動物，空氣栓塞處死，游離橈骨標(biāo)本備檢。表1 分組和處理（略）1.4.3 BMP2和TGF?撥?2的用法 參照Miyamoto6的方法，在各個實驗組內(nèi)BMP2和TGF?撥?2的含量分別為100 g和20 mg。手術(shù)當(dāng)天將各個緩釋微粒用負(fù)壓系統(tǒng)置入異體骨，對照組在相應(yīng)部位置

6、入自體骨，作空白對照。 1.4.4 X線片觀察 各組動物的橈骨分別在100 mA、50 KV、10 ms、靶物距75 cm的條件下攝X線正側(cè)位片。對術(shù)后第4、8、10、12周，X線正側(cè)位片顯示的骨痂在圖形分析系統(tǒng)上使用qwin軟件作圖像分析，測定外骨痂的總面積。 1.4.5 骨標(biāo)本采集 拍攝X線片后，各組動物予靜脈注射過量空氣栓塞處死，完整取下橈骨，清除各種軟組織，作進(jìn)一步分析。 1.4.6 生物力學(xué)測定 對術(shù)后12周的橈骨標(biāo)本在萬能材料試驗機上作三點彎曲、最大破壞載荷試驗，測定標(biāo)本骨折端的最大破壞載荷和最大位移（由太原理工大學(xué)生物力學(xué)研究所提供）（圖1）。圖1生物力學(xué)三點彎曲模式圖（略）1.

7、4.7 骨密度（骨痂處）測定 做完X線檢查的標(biāo)本，去除標(biāo)本表面的所有軟組織，用美國Luner公司DPX?IQ型雙光子骨密度測定儀（DEXA）測量骨缺損區(qū)新骨的骨密度（BMD），采用普通區(qū)域分析方式，在骨缺損區(qū)（R1）以盡量包含全部骨缺損的最小面積為原則，掃描分析測定不同時間標(biāo)本骨缺損區(qū)的骨密度，小動物實驗軟件分析測定結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（圖2）。圖2骨密度測定感興趣區(qū)R1（方塊）（略）1.4.8 單位質(zhì)量骨痂中鈣含量測定 取骨折近端骨痂，經(jīng)漂洗、脫脂、烘干后，精確稱重，用三氯乙酸0.1 gml脫鈣，回滴定法測定鈣含量。 1.4.9 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料用x-s表示，差異的顯著性用方差分析，各

8、實驗組之間比較用LSD法檢驗，與對照組之間比較用Dunnett檢驗。 2 結(jié)果 2.1 X線片觀察結(jié)果 D組術(shù)后2周，缺損處截骨線模糊，有密度較低可見均勻的骨痂影，移植骨紋理模糊，出現(xiàn)不規(guī)則密度降低區(qū)。4周時，缺損內(nèi)骨痂密度明顯增高，充滿整個缺損區(qū)，并有許多島狀骨化中心，移植骨部分吸收，移植骨與骨缺損端連接線模糊（圖3）。8周時，缺損區(qū)內(nèi)骨島增大，并與骨痂相互融合呈片狀密度增高影，部分新生骨皮質(zhì)與宿主骨皮質(zhì)連接（圖4）。12周時，缺損區(qū)新骨形狀已接近正常骨組織，中央部已基本形成骨髓腔，并與近、遠(yuǎn)端相通，外周骨皮質(zhì)也與兩端相連，基本達(dá)到正常厚度（圖5）。A組在術(shù)后8周，僅在骨缺損端有少量新骨形成

9、，并有部分軟組織填充，12周時：斷端邊緣消失，骨膜反應(yīng)密度更深，密度較骨質(zhì)低（圖6）。C組上述變化均晚于D組（圖79）。B組在12周已完全愈合（圖10）。 圖34周D組：缺損內(nèi)骨痂充滿整個缺損區(qū)，移植骨部分吸收，移植骨與骨缺損端連接線模糊（略） 圖48周D組：缺損區(qū)移植骨與缺損斷端全部連接，密度較高，新生骨皮質(zhì)與宿主骨皮質(zhì)連接 （略）圖512周D組：缺損區(qū)已接近正常骨組織，中央部基本形成骨髓腔，并與近遠(yuǎn)端相通，外周骨皮質(zhì)也與兩端相連（略）圖612周A組：骨缺損區(qū)斷端邊緣消失，密度較骨皮質(zhì)低（略）圖74周C組：缺損內(nèi)骨痂未充滿整個缺損區(qū)，移植骨部分吸收，移植骨與骨缺損端連接線模糊（略）圖88周C

10、組：缺損區(qū)移植骨與缺損斷端部分連接，部分新生骨皮質(zhì)與宿主骨皮質(zhì)連接（略）圖912周C組：缺損區(qū)新骨與缺損斷端完全連接，密度較高，中央骨髓腔未通，新骨皮質(zhì)與兩端骨皮質(zhì)相連（略）圖1012周B組：缺損區(qū)與移植骨完全連接，外周骨皮質(zhì)相連，骨髓腔再通（略）2.2 骨密度測定 術(shù)后各時期A、B、C和D 4組分別測定骨缺損區(qū)骨密度值（表2）?？傮w來說：4組的骨密度隨時間增加而增加。在各個時間段，對照組的骨密度高于各個實驗組，D組的骨密度高于A、C組，其中4周和8周兩者比較差異具有顯著性。D組在4周和8周時明顯低于B組，在10周和12周時已沒有明顯差別。 2.3 生物力學(xué)測定 術(shù)后12周，行三點彎曲試驗（表

11、3），得各組骨缺損區(qū)最大應(yīng)力如下，B組和A、C組比較有顯著性差異，和D組無明顯差別。D組和A、C組比較有顯著性差異。表2 各組不同時期骨密度值（略）C組與D組（x-s）比較:*P0.05;*P0.01;A組與D組（x-s）比較:P0.05;P0.01;B組與D組（x-s）比較:*P0.05表3 12周各組三點彎曲試驗數(shù)據(jù)（略）C組和D組比較:*P0.05;A組和D組比較:P0.05;A組和B組比較:P0.01 ;C組和B組比較:P0.05;B組和D組比較：P0.052.4 單位質(zhì)量骨痂中鈣含量 骨折后50 d，對照組單位質(zhì)量骨痂鈣含量（mg）為（257.511.4），TGF?撥?2組為（238

12、.215.1），BMP2組為（218.716.8），TGF?撥?2+ BMP2組為（251.218.9）。對照組明顯高于各治療組（各治療組與對照組相比，P0.01），TGF?撥?2+ BMP2組高于單用TGF?撥?2和BMP2組，TGF?撥?2組高于BMP2組（各治療組之間兩兩比較，P0.05）。TGF?撥?2+BMP2組與對照組比較無差別（P0.05）。 3 討論 骨形態(tài)發(fā)生蛋白由一個結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽因子家族（BMP1除外）組成，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員。這個家族有43個成員，TGF?撥錄易宓某稍痹詿蠖嗍?物種都可發(fā)現(xiàn)。BMP可誘導(dǎo)骨及軟骨形成,BMP2的多樣性效能涉及從骨骼、骨外器

13、官形成到骨的發(fā)生與重建7。 研究發(fā)現(xiàn)，TGF?撥?2有誘導(dǎo)和增強骨形成的作用1、6，BMP2明顯促進(jìn)骨愈合，有較強的骨修復(fù)能力3。將外源性TGF?撥?2和BMP2復(fù)合用于骨折治療的研究報道較少，而與同種異體骨復(fù)合則未見相關(guān)報道。同種異體骨從材料本身的角度分析最適于修復(fù)骨缺損，Kirker8 用綿羊的異體骨復(fù)合rhBMP?2修復(fù)2.5 cm的骨缺損，術(shù)后24周即可從X線片上見到新骨形成，12周髓腔再通，為異體骨移植中應(yīng)用BMP提供了實驗依據(jù)。本實驗以同種異體骨為載體，分別制備了TGF?撥?2/異體骨、BMP2/異體骨、TGF?撥?2+ BMP2/異體骨緩釋系統(tǒng)，局部用在兔橈骨骨折處，從X線片、生

14、物力學(xué)、骨密度和骨痂鈣含量方面觀察外源性TGF?撥?2和BMP2對骨折愈合的作用。結(jié)果表明，在骨折區(qū)應(yīng)用TGF?撥?2和BMP2，可明顯促進(jìn)骨折愈合，使骨痂量增多，單位骨痂的鈣含量明顯增加，增強骨折愈合后的力學(xué)強度。TGF?撥?2和BMP2聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于單用一種生長因子，單用TGF?撥?2好于單用BMP2。而且在第8周時TGF?撥?2和BMP2聯(lián)合應(yīng)用組的骨密度和自體骨組在統(tǒng)計學(xué)上已沒有明顯差別；在第12周時，生物力學(xué)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。說明異體骨復(fù)合外源性TGF?撥?2和BMP2可以在骨折愈合時間上最大限度地接近自體骨移植骨折愈合的時間，可以用比其他植入材料短的時間達(dá)到相同的效果。通過本實驗

15、可估計出愈合時間大概在812周，縮短了臨床上需要大段植骨患者的治療時間，減輕了患者的痛苦。其應(yīng)用前景廣闊，同時也可以為異體骨復(fù)合何種因子及因子的劑量提供一個可靠的參考指標(biāo)。 結(jié)果表明，TGF?撥碌淖饔們坑?BMP，可能是TGF?撥陸齠怨悄涑渲氏赴?作用，不能誘導(dǎo)骨折缺損區(qū)周圍肌肉中間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，其成骨范圍僅局限于骨折缺損區(qū)內(nèi)2。而BMP對已分化、成熟的成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞無生物學(xué)效應(yīng)（基本上無促進(jìn)增殖作用）3，因而，TGF?撥碌某曬親饔們坑?BMP。本實驗D組結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用對骨折愈合的促進(jìn)作用明顯增強，力學(xué)強度進(jìn)一步加大。這提示它們之間有協(xié)同作用。體內(nèi)研究表明3，BMP誘導(dǎo)未分化

16、的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，通過鈣鹽沉積，導(dǎo)致新骨形成，啟動骨生成，具有高效的異位誘導(dǎo)成骨作用，但對已分化、成熟的成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞無作用，它誘導(dǎo)新骨形成的過程需要一些生長因子（如TGF?撥攏牟斡耄?TGF?撥碌鬧苯有譴俳?骨膜中前成骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的增殖，在骨形成中的基本作用是補充其他生長因子（如BMP）激活已分化的細(xì)胞，無異位成骨活性。大量研究證實，BMP是唯一能夠誘導(dǎo)異位成骨的生長因子，TGF?撥輪揮性?BMP存在時，才能誘導(dǎo)異位成骨。因此，當(dāng)TGF?撥潞?BMP復(fù)合時，BMP的異位骨誘導(dǎo)作用彌補了TGF?撥碌牟蛔悖?使TGF?撥碌某曬悄芰鑾浚?

17、而TGF?撥履茉黽?BMP的誘導(dǎo)能力。由此可見，在促進(jìn)骨生成方面，TGF?撥潞?BMP之間有良好的協(xié)同作用。 本實驗結(jié)果顯示同種異體骨能夠和上述兩種因子很好的兼容并且彼此之間有良好的協(xié)同作用，但目前對于同種異體骨植入后愈合機理、免疫反應(yīng)等的研究尚未十分透徹，而且在如何保存骨組織，以求在安全前提下最大程度地降低免疫原性，并加快植入后的骨愈合速度等方面亦存在爭議，有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Urist MR.Bone formation by autoinduction,1965J.Clin Orthop,2002,（395）:4?10.2 Lind M.Growth factor stim

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