小鼠哮喘模型中白細胞介素5等對嗜酸細胞凋亡的調(diào)控作用

1、    小鼠哮喘模型中白細胞介素5等對嗜酸細胞凋亡的調(diào)控作用        先前我們已證實在小鼠哮喘模型中白細胞介素5(IL-5)和IL-10分別上行和下行調(diào)節(jié)氣道炎癥，二者的動態(tài)平衡是決定嗜酸細胞（EOS）浸潤與消散的重要因素1。我們的研究進一步動態(tài)觀察哮喘動物模型氣道炎癥全過程的變化，旨在探討炎癥促進因子IL-5和炎癥抑制因子IL-10對EOS凋亡的調(diào)節(jié)作用。對象與方法哮喘模型制作：10周齡BALB/c小鼠10只，雌雄不限，體重（10±2）g，由華西醫(yī)科大學動物

2、中心提供。所有動物隨機分配為對照組（11只）、致敏激發(fā)（SC）組（77只）。SC組小鼠腹腔注射10%卵白蛋白（OVA）0.1 ml及10%氫氧化鋁凝膠0.2 ml致敏。14 d后以1% OVA溶液超聲霧化，通入霧化吸入箱5 min后放入小鼠繼續(xù)霧化20 min激發(fā)。連續(xù)激發(fā)3 d。對照組小鼠在相同時間腹腔注射和霧化吸入等量生理鹽水。支氣管肺泡灌洗（BAL）與細胞分離：對照組小鼠及末次激發(fā)后0、8、24、48、96 h、7、14 d的SC組小鼠進行BAL。在小鼠氣管內(nèi)分3次（0.7 ml、0.6 ml、0.5 ml）緩慢注入37、去鈣、鎂離子Hank平衡鹽液，緩慢回吸，回收液（BALF）在1.3

3、51.55 ml為合格樣本平均（1.4±0.3）ml。1 500 r/ min，離心10 min，上清液作細胞因子檢測。細胞用1 ml Hank液重懸，在2 h內(nèi)作凋亡檢測。BALF中IL-5、IL-10測定：采用小鼠IL-5、IL-10酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（美國ENDOGEN公司），按試劑盒說明書進行操作。EOS的標記和凋亡檢測：BALF加等量生理鹽水稀釋，離心洗滌，生理鹽水重懸細胞，取70 孔徑尼龍篩網(wǎng)過濾并低速離心，調(diào)整細胞濃度為106/ml，加入CD 49 d-FITC和CD15-PE各10 U，室溫避光孵育15 min后，加入5 ml PBS緩沖液離心洗滌。

4、將已標記雙色單抗的細胞（EOS細胞）固定打孔。經(jīng)以上步驟處理的細胞轉(zhuǎn)入流式上機試管，加入1 ml紅色（PI）工作液作DNA染色，15 min后上流式細胞儀檢測。統(tǒng)計學處理：各組間及不同時間采用樣本均數(shù)t檢驗，不同指標的相互關(guān)系采用直線相關(guān)分析。結(jié)果BALF中IL-5、IL-10濃度見表1。表1兩組小鼠BALF 中IL-5、IL-10濃度分析（±s）組別鼠數(shù)IL-5（pg/ml）P值IL-10（pg/ml）P值對照組107.4±3.111±4SC0 h組108.2±2.4>0.0512±3>0.05SC8 h組1014.4±

5、3.8<0.00118±5<0.01SC 24 h組1026.8±5.5<0.00111±9>0.05SC 48 h組930.6±13.4<0.00113±7>0.05SC 96 h組1027.5±8.8<0.00119±3<0.001SC7 d組1012.4±3.2<0.0516±3<0.05SC 14 d組86.4±2.1>0.0513±3>0.05注：與對照組比較 EOS凋亡率：SC組EOS凋亡率在8 h及7

6、14 d形成兩個峰值，但僅714 d與對照組比較差異有顯著性，其余時相凋亡率與正常對照組相似或略低，差異無顯著性（P>0.05），見表2。表2兩組小鼠EOS凋亡率分析（±s）組別 鼠數(shù) 凋亡率（%） P值對照組 10 3.1±1.6 SC0 h組 10 3.2±1.6 >0.10SC8 h組 10 4.6±1.7 >0.10SC 24 h組 10 2.7±1.4 >0.10SC 48 h組 9 2.9±1.3 >0.10SC 96 h組 10 3.5±0.9 >0.10SC7 d組 10

7、5.2±2.0 <0.05SC 14 d組 8 6.8±2.1 <0.01注：與對照組比較 EOS凋亡率與IL-5、IL-10相關(guān)性：SC組各時相IL-5、IL-10濃度與相應(yīng)時相EOS凋亡率作直線回歸分析，未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)關(guān)系。若以IL-10/IL-5比值與凋亡率作直線回歸分析，則顯示有正相關(guān)關(guān)系（r=0.74, P<0.01），若從8 h開始分析，則相關(guān)更為密切（r=0.988,P<0.001）。討論EOS是哮喘氣道局部主要的損傷性炎癥細胞，我們在動態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)EOS在誘喘后迅速出現(xiàn)于氣道中，但在炎癥的后期（96 h14 d）數(shù)量逐漸減少。近年研究證

8、實，除肺內(nèi)募集減少、重新分布與壞死外，細胞凋亡可能是 EOS減少的另一種原因。我們的研究再次證實，哮喘氣道浸潤的EOS存在凋亡現(xiàn)象。有人認為哮喘氣道局部凋亡-抗凋亡機制失調(diào)，EOS凋亡不足或延遲是EOS 大量浸潤的成因之一2。如郭曉明等3報道，哮喘動物EOS凋亡率為（2.1±1.3）%，而對照組為（10.1±3.4）%，哮喘組EOS中凋亡抑制基因產(chǎn)物BCL-2的表達亦高于對照組。但我們的研究結(jié)果顯示，哮喘組EOS凋亡率總體水平并不低于對照組，而在炎癥初期與后期僅有所增高，即EOS浸潤過程始終伴隨有凋亡之現(xiàn)象，提示致喘誘因在啟動炎癥反應(yīng)的同時，亦啟動凋亡程序，可能為機體防止炎

9、癥損傷持續(xù)與擴大化的保護反應(yīng)。本組研究測得EOS凋亡率在3%7%之間，因凋亡的形成與被清除過程僅為數(shù)秒數(shù)分鐘，這一水平的凋亡率對EOS在氣道中的數(shù)量亦會產(chǎn)生顯著的影響，故我們認為EOS凋亡是炎癥消退的重要途徑之一。凋亡在體內(nèi)受死亡基因及其產(chǎn)物（配體-受體）和多種細胞因子的調(diào)節(jié)。Th2 細胞因子、IL-5、IL-3、粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）是主要的EOS生長支持因子，體外實驗顯示，培養(yǎng)中的EOS若剝奪上述因子，則迅速發(fā)生凋亡4。IL-10亦由Th2細胞分泌，但對Th1、 Th2多種細胞因子的合成具有阻遏活性，是重要的免疫-炎癥反應(yīng)下行調(diào)節(jié)因子，目前尚無IL-10直接誘發(fā)EOS凋亡

10、的證據(jù)，因其對IL-4、IL-5、GM-CSF有強烈的合成抑制作用，推測應(yīng)為一種凋亡促進因子。本組實驗未在IL-5或IL-10與凋亡率之間發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)IL-10/IL-5比值與EOS凋亡率有顯著正相關(guān)，提示在炎癥局部，凋亡并非由單一因子決定，而是受到因子間相互作用的影響。IL-5與IL-10的相互變動不僅決定炎癥的啟動和進展，亦影響炎性細胞的凋亡和炎癥消散。基金項目：國家自然科學基金資助（39570329）作者單位：劉春濤（610041 成都，華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科）王曾禮（610041 成都，華西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科）梁宗安（610041 成都，華西醫(yī)科大學附屬第

11、一醫(yī)院呼吸內(nèi)科）雷松（腫瘤治療中心）參考文獻1，劉春濤，王曾禮，馮玉麟，等. 哮喘動物模型氣道中白細胞介素5、10的動態(tài)變化及其意義. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，4：239-242. 2，Wedi B, Raap U, Lewrick H, et al. Delayed eosinophil progrommed cell death in vitro: a common feature of inhalant allergy and extrinsic and intrinsic atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol , 1997,100:536-543.3，郭曉明，賴克方