發(fā)酵工程實驗

1、實驗一 酸奶的制作與乳酸菌的活菌計數(shù) 5 學(xué)時實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理與方法。2、了解市售酸奶的生產(chǎn)工藝。3、掌握乳酸菌活菌計數(shù)方法與操作。實驗原理：乳酸菌在乳中生長繁殖，發(fā)酵分解乳糖產(chǎn)生乳酸等有機酸，導(dǎo)致乳的 pH 值下降， 使乳酪蛋白在其等電點附近發(fā)生凝集。乳酸菌屬于兼性厭氧微生物，在無氧條件下生長繁殖較好，實驗室條件下利用混 菌培養(yǎng)的方法，盡可能讓乳酸菌在無氧條件下生長，每個單菌落代表一個微生物細胞。 實驗內(nèi)容：一酸奶制作1、 10%脫脂奶粉溶解于熱水80C左右中，充分攪拌均勻，配成調(diào)制乳；2、添加蔗糖： 為了緩和酸奶的酸味， 改善酸奶口味， 在調(diào)制乳中加人 4-8 的

2、蔗糖。3、 滅菌：方法有兩種：將乳加熱至90'C,保溫5min ;4、 接種：往冷卻到 43-45C滅過菌的乳中加入乳酸菌，接種量為2%-5%。5、分裝：酸奶受到振動，乳凝狀態(tài)易被破壞，因此，不能在發(fā)酵罐容器中先發(fā)酵 然后再進行分裝，須是將含有乳酸菌的牛乳培養(yǎng)基先分裝到小容器中，加蓋后送入恒 溫室培養(yǎng)，在小容器中發(fā)酵制成酸奶。6、發(fā)酵：發(fā)酵的溫度保持在 40-43 C, 一般發(fā)酵時間為 3-6h。 發(fā)酵終點確實定有兩種方法：1檢測發(fā)酵奶的酸度，到達 65-70 T 。°2傾斜觀察，瓶內(nèi)酸奶流動性差，而且瓶中部有細微顆粒出現(xiàn)。7、 冷卻：發(fā)酵結(jié)束，將酸奶從發(fā)酵室取出，用冷風(fēng)迅速

3、將其冷印到10C以下，一 般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生長，防止酸奶酸度過高而影響口感。8、 冷藏和后熟：經(jīng)冷卻處理的酸奶，貯藏在2-5 C的冷藏室中保存。9、感官指標(biāo)1色澤：色澤均勻一致，呈乳白色，或稍帶微黃色。2組織狀態(tài)：凝塊稠密結(jié)實均勻細膩，無氣泡，允許少量乳清析出。3氣味：具有清香純潔的乳酸味，無酒精發(fā)酵味，無霉味和其他外來不良氣味。 二乳酸菌活菌檢測 、檢測培養(yǎng)基：蛋白胨 15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化鈉5g，碳酸鈣10g， 瓊脂粉20g，水1000ml，115121 C滅菌20min，滅菌后放置水浴 52 C保溫備用。 、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無菌水的帶4-6

4、顆玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm 震蕩30min，即為101樣品溶液；再從中取 1ml至添加9.0ml 無菌生理鹽水三角瓶中，稀釋至102，以此類推稀釋至108，即稀釋了 1億倍; 、倒培養(yǎng)平板，從上述已稀釋了1億倍的乳酸菌懸液中取 1ml，在無菌操作臺上注入9.0cm 培養(yǎng)皿中，再將已經(jīng)滅了菌的保持在52 C水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，與菌懸液充分混合均勻倒 入培養(yǎng)基后，馬上用手轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)動幾下，讓其混合均勻，然后等其凝固 再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意最后一步倒平皿必須在超凈臺無菌操作，以免雜菌污 染。每次稀釋均要換滅好菌的移液管。

5、 、培養(yǎng)條件：37 C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4872h。 、培養(yǎng)完畢后，取出進行計數(shù)，因為是稀釋了1億倍，所以一個透明圈菌落代表 1億/克，如果有200個透明圈，則是200億/克。實驗器材及試劑：菌種：市售酸奶試劑：白糖 奶粉 培養(yǎng)基各成分器材：培養(yǎng)箱、電爐、鋁鍋 5L,培養(yǎng)皿，酸奶發(fā)酵瓶自帶 實驗結(jié)果：1、詳細描述自己制作的酸奶結(jié)果：答：制作后酸奶與市場所售酸奶比較，比市場所售酸奶更稠密，酸奶的香味與酸 味明顯，制作成功2、記錄個人酸奶中各菌數(shù)測定的平行數(shù)據(jù)，計算最終平均值。答：最終培養(yǎng)基上未岀現(xiàn)乳酸菌菌落，全部為雜菌菌落，因此無法統(tǒng)計酸奶中的 菌含量3、同時用圖片記錄實驗過程中各現(xiàn)象與結(jié)果并對圖

6、進行注釋。答：制備乳酸菌時，瓶子上方留有一部 分空間，并未使乳酸菌完全處于無氧環(huán) 境中發(fā)酵，但乳酸菌是兼性厭氧菌，因 此在存在少量氧氣的環(huán)境中，乳酸菌也 可以生長，酸奶制備成功。但在平板接 種時，由于污染雜菌，乳酸菌并未長出。 乳酸菌計數(shù)失敗。思考題：乳酸菌的保藏通常為低溫條件，這給運輸、保藏帶來很大的成本，請問可采用什 么方法使乳酸菌在常溫條件下有很高的存活率？答：在基因水平上對乳酸菌進行基因重組，從而獲得耐高溫乳酸菌。 在基因庫里篩選抗高溫的基因并利用基因重組技術(shù)將其重組在乳酸菌基 因上，對乳酸菌的基因進行修飾使其表達，以此來獲得耐高溫菌株。實驗二 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵及活菌數(shù)測定 5 學(xué)

7、時實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)了解固態(tài)發(fā)酵原理；2、以枯草芽孢桿菌為對象，了解固態(tài)發(fā)酵的控制技術(shù)；3、掌握枯草芽孢桿菌活菌計數(shù)方法與操作。實驗原理： 作為抗生素的替代品，益生菌和酶制劑等的研究與開發(fā)近幾年成為綠色飼料添加劑的熱點，其中益生菌倍受關(guān)注。作為益生菌的一種，芽孢桿菌制劑在動物生產(chǎn)中的 研究和應(yīng)用一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點。目前芽孢桿菌多采用液體深 層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進行生產(chǎn)，對設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜；而固體發(fā)酵采 用的原料一般是廉價的農(nóng)副產(chǎn)品（如草粉、麩皮等 ） ，采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵。所以近年來各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發(fā)酵 技術(shù)

8、，以求簡化生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。固態(tài)發(fā)酵定義：指沒有或幾乎沒有自由水存在下，在有一定濕度的水不溶性固態(tài) 基質(zhì)中，培養(yǎng)一種或多種微生物的生物反應(yīng)過程，是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過程?？莶菅挎邨U菌屬于好氧微生物，實驗室條件下利用稀釋涂布培養(yǎng)的方法，讓菌在 有氧條件下生長，每個單菌落代表一個微生物細胞。實驗內(nèi)容：1、液體種子培養(yǎng)基配制：葡萄糖 0.2%，NaCl 0.5% ，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，pH 7.0。2、液體種子培養(yǎng)：每300 mL三角瓶裝量50 mL液體種子培養(yǎng)基，在 115C條件下滅菌30 min。降溫后從斜面接一環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基。置37'C控溫搖床培養(yǎng)

9、。轉(zhuǎn)速200 r min-1 ,至芽孢率達 90%以上時停止 ，約需 24 h。3、固體發(fā)酵培養(yǎng)基： 麩皮 60%，稻草粉 10%，玉米粉 5% ，豆粕 25%，硫酸鎂 0.05% ， 硫酸銨 0.5% ， 。4、三角瓶固體發(fā)酵培養(yǎng)：每250 mL三角瓶裝量20-30 g濕重，固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料試劑混合料，加水，,攪拌均勻，培養(yǎng)基經(jīng)121 C滅菌30 min，降溫后接種量為2%（V/M : V 液體菌種體積 數(shù)，M 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量），然后置37C培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間時拍打，使其均 勻生長。至脫落芽孢率為 80%以上時，停止發(fā)酵，約需 48 h。二枯草芽孢菌活菌檢測 、檢測培養(yǎng)基：葡萄糖

10、0.2%，NaCI 0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%,瓊脂粉2%，pH 7.0。115 C滅菌20min，滅菌后放置水浴 52 C保溫備用。 、稀釋：取10克樣品放入添加90ml無菌水的帶玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床180rpm 震蕩30min，即為101樣品溶液；再從中取 1ml至添加9.0ml無菌生 理鹽水的三角瓶中，稀釋至 102,以此類推稀釋至108，即稀釋了 1億倍； 、倒培養(yǎng)平板，將已經(jīng)滅了菌的保持在52 'C水浴鍋中的呈溶解狀態(tài)的培養(yǎng)基，倒入15毫升左右于培養(yǎng)皿中，全部浸到培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固；從上述已稀釋了1億倍的菌懸液中取 ml于已凝固的培養(yǎng)基外表，用玻璃刮鏟

11、涂布均勻，靜止10min ，然后再移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 、培養(yǎng)條件：37 C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2448h ; 、培養(yǎng)完畢后，取岀進行計數(shù)。三芽抱率測定：采用芽抱革蘭氏染色后顯微鏡下觀察實驗器材及試劑：菌種：枯草芽抱桿菌試劑：培養(yǎng)基成分器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋，培養(yǎng)皿實驗結(jié)果：1、詳細描述枯草芽抱桿菌固態(tài)培養(yǎng)物外觀、氣味、培養(yǎng)物狀態(tài)等：答：枯草芽抱桿菌淡黃色，中間色深，外表較平整，無光澤，邊緣不整齊，形成的菌落為圓形。培養(yǎng)基中的枯草芽抱桿菌有腥臭味，長勢良好，觀察培養(yǎng)基，無明顯染菌現(xiàn)象。2、記錄活菌測定中各平行數(shù)據(jù)，計算最終平均值。答：數(shù)量稀釋倍數(shù)密度/g第一個平板1125X107X109第二個平板65

12、5X107X109第三個平板225X107X109平均值X1093、同時用圖片記錄實驗過程中各現(xiàn)象與結(jié)果，并對圖進行注釋菌落成白色，菌落外表有褶皺思考題：在枯草芽抱桿菌固態(tài)生產(chǎn)過程中，為了防止霉菌與酵母的污染，可如何進行操作?答：加入抗真菌抑制劑實驗三、淀粉糖化與酒精發(fā)酵5學(xué)時實驗類型：綜合性實驗?zāi)康模?了解酒精發(fā)酵的主要類型、工藝原理及其控制條件2 熟悉酒精生產(chǎn)的工藝流程、掌握酒精發(fā)酵的操作方法3. 掌握用酶法從淀粉原料到水解糖的制備原理及方法4. 掌握在實驗室中模擬酒精發(fā)酵的工藝流程實驗原理玉米粉、大米粉中可供發(fā)酵的物質(zhì)主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應(yīng)的酶，所以不能直接利用淀粉進行酒精發(fā)

13、酵，因此必須對原料進行預(yù)處理，包括蒸煮液化、糖化等，蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細胞，形成均一的醪液，能更好的接受糖化酶的 作用，并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，以便酵母進行酒精發(fā)酵。在無氧條件下酵母菌利用可發(fā) 酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的作用，稱為酒精發(fā)酵，是生產(chǎn)酒精及各種酒類的基礎(chǔ)， 可通過測定發(fā)酵過程中產(chǎn)生 C02的量和最終產(chǎn)物酒精的量得知酵母的發(fā)酵能力。實驗內(nèi)容1、原料的粉碎將玉米、大米用粉碎機粉碎，玉米淀粉含量為70%，大米淀粉含量為75%。2、蒸煮糊化稱取一定量的粉碎后淀粉質(zhì)原料，按一定的料水比100g: 200ml，調(diào)制淀粉乳，90-100 'C條件下恒溫水浴加熱，淀粉乳受熱后，在一定溫

14、度范圍，淀粉 粒開始破壞，晶體結(jié)構(gòu)消失，體積膨大，粘度急劇上升，呈粘稠的糊狀，即成為非結(jié) 晶性的淀粉。3、糖化經(jīng)蒸煮糊化后的醪液，經(jīng)過淀粉酶的糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為 可發(fā)酵性糖，供酵母利用糖化時間與時化睡用量關(guān)系駁墓祀時詢(h)8101&243248焙化醸用1 (U/g注粉)4S04(193202"1弭15072IA0酶參考用量：淀粉乳 33%，60C，酶240U/g絕干淀粉，糖化時間16h。糊化醪液調(diào)整pH4.5，往其中加入一定量的淀粉酶120U/g、糖化酶120U/g丨,60C恒溫下不斷攪拌，直至粘度下降到一定程度，淀粉完全糖化4、發(fā)酵1干酵母活化將干酵母按1:2

15、0的比例投放于 37C的溫水中復(fù)水 20min。目的：恢復(fù)酵母細胞的正常功能。2淀粉醪液糖化后，取 400ml上清液于潔凈的大可樂瓶中，加相同體積的水稀釋，加入活化好的酵母種液 5ml，混勻，28度培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng) 36h左右。5、二氧化碳生成的檢驗1觀察三角瓶中的發(fā)酵液有無氣泡溢出；2滴入10%氫氧化鈉1ml于發(fā)酵液試管中，觀察，如氣體逐漸消失，則說明有二氧化碳的存在；6、 二氧化碳生產(chǎn)量的測定1接種完，擦干瓶外壁，于天平上稱量，記為W1;2丨實驗結(jié)束，取岀瓶輕輕搖動，使二氧化碳盡量溢岀，在同一天平上稱量，記為W2 ; 3二氧化碳生成量 =W1-W27、酒精生成的檢驗1打開瓶塞，嗅聞有無酒精

16、氣味；2取發(fā)酵液5ml，力口 10%硫酸2ml;3再加入1% K2ChO7溶液10-20滴，如顏色由黃色變?yōu)辄S綠色說明有酒精產(chǎn)生。K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH CH3C00H+K2SO4+Cr2S043 實驗器材及試劑：菌種：活性干酵母試劑：培養(yǎng)基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可樂瓶溶液：10% H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH器材：試管、培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、水浴鍋、粉碎機、離心機實驗結(jié)果：1、詳細記錄實驗過程中各參數(shù)及數(shù)據(jù)。淀粉淀粉酶CaCb糖化酶100g10g2.對實驗結(jié)果的判斷與分析。答：1二氧化碳生成的檢驗培養(yǎng)約 48h后，觀察瓶中 混

17、合液，淀粉大部分沉降在瓶底， 上清濃度較稀， 靠瓶壁邊緣有一連串微小氣泡2酒精生成的檢驗打開瓶塞，聞到有濃重酒精氣味。取發(fā)酵液 5ml,力口 10%硫酸2ml,加1%KCr2。溶液10-20滴，顏色由黃色變?yōu)辄S綠色，稍加熱后現(xiàn)象產(chǎn)生更快，更明顯。思考題：現(xiàn)有3株不同來源的酒精酵母，請設(shè)計與本實驗操作不同的實驗，判斷哪株 酵母發(fā)酵酒精能力最強？ 答：按實驗步驟配制等量的三組醪液，加入等量糖化酶進行糖化作用，將原料中的淀3株不同來源的酒精酵母CO2的質(zhì)量，進行比較。粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，向三組糖化后的淀粉上清中加入等量 種液，相同條件下培養(yǎng)一段時間，分別測定三組實驗產(chǎn)生的 產(chǎn)CO2越多表示發(fā)酵酒精能

18、力越強。實驗四 黑曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶及酶解底物反應(yīng)5學(xué)時實驗?zāi)康?：1、了解黑曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)酶情況2、掌握微生物固體發(fā)酵操作技術(shù)3、了解纖維素酶提取方法及酶活性定性測定方法實驗原理 ：纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶系， 屬 于誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生需要纖維素類物質(zhì)的誘導(dǎo)。實驗中以米曲霉為發(fā)酵菌株，稻草作為 產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。實驗內(nèi)容1、黑曲霉菌種活化1配制 PDA 培養(yǎng)基：稱取 200g 馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水 1000ml 煮沸半個 小時，紗布過濾，再加 20g 葡萄糖和 20g 瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管， 每試管約5-10ml視試管大小而定，15磅蒸氣

19、121 C丨滅菌20分鐘左右后取出試 管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?在無菌超凈臺上接種保藏的黑曲霉于PDA斜面，28C培養(yǎng)5-7天，斜面上長滿孢子。2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基：15g麩皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4 , 0.5% (NH4)2SO4，加 15ml水加水量40%60%，拌勻，裝瓶；3、滅菌：121 C 滅菌30min，冷卻至室溫。4、黑曲霉孢子懸浮液制備已培養(yǎng)好的黑曲霉孢子斜面一支， 加入約 10ml 無菌水， 洗下孢子， 制成孢子懸液。5、接種： 用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液， 移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中， 于30度條件下培養(yǎng)96h，期間每隔12h搖動三角瓶一次。6、提取粗

20、酶液向瓶中加入無菌水約 50ml，浸泡固體曲30min-1h ;過濾得粗酶液。7、酶活性測定 1 配制 1%CMC 底物平板：配方：1g羧甲基纖維素鈉，1.8g瓊脂，100ml，瓊脂完全溶解后，加入 0.03g曲利 本藍，倒平板，每皿約 15ml。 2打孔：打孔器經(jīng)酒精燃燒滅菌后，每平板打4 孔，并在酒精燈火焰上稍稍加熱打孔處，使孔周圍的培養(yǎng)基微融，然后平放冷卻。 3加樣：往孔內(nèi)加入粗酶液適量約100ul ，同時需設(shè)對照。4培養(yǎng)反應(yīng)：將加樣后的平板小心平端放入 30C培養(yǎng)箱，放置20小時左右。 5觀察結(jié)果：可直接觀察透明圈有無、測定透明圈直徑。實驗器材及試劑：菌種：黑曲霉試劑：土豆、稻草、麩皮

21、、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉CMC器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機、天平、三角瓶實驗結(jié)果：1、仔細觀察固體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答：固體培養(yǎng)基發(fā)酵前：培養(yǎng)基顏色較淺，各成分麩皮、稻草新鮮，粘度大 成團狀固體培養(yǎng)基發(fā)酵后：培養(yǎng)基中產(chǎn)生較多黑色抱子及菌體，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被 利用，體積縮小2、仔細觀察底物平板酶解前后的現(xiàn)象，并測量水解圈大小?，F(xiàn)象：紙片周圍出現(xiàn)淺淺的水解圈，打孔培養(yǎng)基未出現(xiàn)水解圈，紙片直徑2.5cm，水解圈3cm，直徑比5:6思考題：纖維素是自然界最豐富的資源，從理論角度分析如何最大限度地通過酶法利 用該資源？而現(xiàn)實存在什么問題？目前對纖維素降解有哪些研究進展？答：要想

22、最大限度的利用纖維素，可從兩個方面入手。一是通過生產(chǎn)高性能纖維素酶的方法，二是找到蘊含能量較高的纖維素。而現(xiàn)實中存在的問題是高性能纖維素 酶的獲取，而可以通過誘變和篩選獲得可產(chǎn)生纖維素酶的新菌株。目前在纖維素的降解方面，微 生物的研究較多，降解纖維素的真菌有很多，如木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、 漆斑霉屬、枝頂抱霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬等。其中，很多纖維素降解真菌在生長 過程中能產(chǎn)生菌絲，菌絲具有很強的穿透能力，能穿透植物角質(zhì)層的阻礙，緊緊依附和穿插在纖維物質(zhì)上，增大降解酶與纖維物質(zhì)的接觸面積，從而加快降解速率。如木霉屬、青霉屬、漆斑霉屬、毛殼霉屬和脈抱霉屬為絲狀真菌。目前，木霉屬是迄今所

23、知纖維素酶系最全面和研究較多的一個屬。實驗五 甘露聚糖酶液體發(fā)酵及酶解反應(yīng) 6 學(xué)時實驗?zāi)康模?. 了解并掌握液體發(fā)酵產(chǎn)酶操作及酶反應(yīng)條件的控制2. 與固體發(fā)酵產(chǎn)酶進行比較分析實驗原理甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，其主鏈是由吡喃甘露糖殘基以1,4-性D糖苷鍵連接而成。當(dāng)主鏈的某些殘基被葡萄糖取代，或半乳糖通過1,6- a-糖苷鍵與甘露糖殘基相連形成分枝，則稱之為異甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和 半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纖維素的第二大組分，在自然界中分布廣泛，且多 以異甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少見。性甘露聚糖酶以內(nèi)切方式降解甘露聚糖主鏈產(chǎn)生不同聚合度的甘露寡糖

24、和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最關(guān)鍵的 酶。甘露聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、紡織印染等行業(yè)。利用性甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在紙漿制造業(yè)，可用于代替堿法進行脫色、漂白。在紡織印染方面，利用性甘露聚糖酶與其它酶聯(lián)合作用，能有效去除產(chǎn)品上粘附的多余染料，降低能耗和對環(huán)境的污染等。甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)將在許多行業(yè)產(chǎn)生很 大的經(jīng)濟和社會效益。因此，近年來甘露聚糖酶逐漸成為國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點之 一。甘露聚糖酶是一種半纖維素酶，其產(chǎn)生需要一定的誘導(dǎo)物存在。本實驗以枯草芽 孢桿菌為菌株，以魔芋粉為誘導(dǎo)物。實驗內(nèi)容1. 菌種活化1 配制 LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10g/L ， 酵

25、母提取物 5g/L ，氯化鈉 10g/L ，瓊 脂 20g/L ，待瓊脂充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約 5-10ml 視試管大 小而定，15磅蒸氣121 C丨滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?在無菌超凈臺上接種保藏的枯草芽抱桿菌于LB斜面，28C培養(yǎng)2天。2. 配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨 10g/L， 酵母提取物 5g/L ，氯化鈉 10g/L ，魔芋粉 30g/L ，3. 以10%的體積量分裝于三角瓶中25ml液體培養(yǎng)基/250ml三角瓶，12仁C 滅菌 20 分鐘；4. 菌懸液的制備已培養(yǎng)好的枯草桿菌斜面一支，加入約 10ml 無菌水，洗下菌體，制成菌懸液。5.

26、接種用移液管在無菌條件下吸取一定量的懸液，移入滅菌好的固體培養(yǎng)基中，于37 度200rpm 條件下培養(yǎng) 72h。6. 粗酶液提取： 3000rpm 離心收集得到粗酶液7. 酶解底物分析：準備兩三角瓶，分別加入 50ml 自來水， 46度水浴保溫8. 往兩三角瓶中各加入 1g魔芋粉，然后其中一個加入粗酶液 1ml，另一個加 入1ml蒸餾水做空白對照。以后每隔5-10min往兩三角瓶中各加入1g魔芋粉, 前后共加5g9. 酶解反應(yīng)30-60min，期間觀察反應(yīng)現(xiàn)象。實驗器材及試劑：菌種：枯草芽抱桿菌試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、魔芋粉器材：培養(yǎng)箱、滅菌鍋、三角瓶、搖床、離心機、天平、三角瓶實驗結(jié)果

27、：1、仔細觀察液體培養(yǎng)基發(fā)酵前后的狀態(tài)，并描述；答： 發(fā)酵之前的液體培養(yǎng)基的狀態(tài)：在配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基時，魔芋粉難溶解，依 舊是固體顆粒。等完全滅完菌后，放正在實驗臺上，等冷卻后，狀態(tài)比較像固體培養(yǎng) 基，但魔芋粉依舊不溶解，其顆粒均勻地分布于培養(yǎng)基中。 經(jīng)過三天的培養(yǎng)之后，產(chǎn)酶培養(yǎng)基被液化，得到的是含有粗酶液的液體培 養(yǎng)基，完全呈黃褐色的液體狀2、仔細觀察底物水解前后的現(xiàn)象。答：對照組：魔芋粉結(jié)成團， 透明，具有彈性, 黏度很大，無法攪拌，實驗難以繼續(xù)。實驗組：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全 是液體狀的酶解產(chǎn)物，溶液呈透明狀。思考題：以本人液體發(fā)酵產(chǎn)酶為例，請詳細介紹甘露聚糖酶定量測定的原理與方

28、法。答：原理：樣品中的甘露聚糖酶對底物-半乳甘露聚糖進行水解，用DNS試劑3,5-二硝基水楊酸分光光度法測定水解所產(chǎn)生的復(fù)原糖量。方法：別向2支試管中加入1.8mL底物溶液，置50C水浴中保溫5min。在其中一 支試管中加入200卩L稀釋酶樣，磁力旋轉(zhuǎn)攪拌均勻，置于50C水浴中準確保溫 5 min。 加入3.0 mL DNS試劑至兩支試管中，攪拌均勻。在另一支試管空白管中加入200卩L稀釋酶樣，同時將兩支試管放入沸水浴中準確保溫5min，取出置入冷水中冷卻至室溫。于540 nm處測量酶樣對空白的吸光度，在酶活標(biāo)準曲線上讀取酶活，再乘以酶 樣稀釋倍數(shù)。實驗六從土壤中別離篩選產(chǎn)抗生素放線菌及抗菌譜

29、分析實驗?zāi)康模?、從土壤中別離產(chǎn)抗生素的放線菌。2、抗生素產(chǎn)生菌的抗菌譜測定。3、掌握微生物的基本操作。實驗原理：放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細菌，一般在 中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種 不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物 群體中別離岀來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。別離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù) 放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基 成分改變，或土壤預(yù)先處理120C熱處理1h，或加入某種抑制劑如加數(shù)滴 10%酚 等，都可以使細菌本實驗加入重鉻

30、酸鉀 150 mg/ L，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從 而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨菌落，并可得 到純菌株。放線菌可以產(chǎn)生抗生素，抑制其他菌種的生長，挑取純菌落進行抗菌譜分 析，指示菌為大腸桿菌G-和枯草芽抱桿菌G+。實驗內(nèi)容1、高氏一號培養(yǎng)基的制備可溶性淀粉 20g，硝酸鉀 1g,氯化鈉 0.5g,K2HPO4 ?3H2O 0.5g ,MgSO4?7H2O 0.5g， FeSO4?7H2O 0.01g，瓊脂 20g，水 1000ml，pH7.4。配制時，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至 1000ml。112 C滅菌20分鐘實驗中所用無菌器 具均在此時滅菌。2、土壤取樣及其懸液梯度稀釋選定取樣點最好是有機質(zhì)含量高的菜地，按對角交叉五點法取樣。先除去 表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取 2 10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng) 是無菌的。將5點樣品約