小麥成熟胚培養(yǎng)及耐鹽突變體的篩選(1)

1、小麥成熟胚培養(yǎng)及耐鹽突變體的篩選葉校成淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2009級(jí)生物工程摘 要：目的利用小麥成熟胚培養(yǎng)技術(shù)獲得愈傷組織以實(shí)現(xiàn)其耐鹽突變體的篩選，并且提高小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率。方法以煤生0308為材料，用正交試驗(yàn)的方法研究6-BAKT2,4-D3種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)小麥愈傷的影響。結(jié)果表明2,4-D的濃度對(duì)愈傷的影響最大，6-BA對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響最小，KT的影響介于二者之間。由正交分析結(jié)果可以得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。關(guān)鍵詞：小麥 愈傷組織 成熟胚 正交法 耐鹽突變體Study on Cult

2、ure of Mature Embryo from Wheat and Screening of Salt-tolerant MutantsYe XiaoCheng Biological Engineering Level 2009 of Huai Bei Normal University Life Science CollegeAbstract:objective The use of wheat embryo culture technology for mature callus to achieve their salt resistance mutants selection, a

3、nd improving wheat mature embryo callus induction rate. method To coal born 0308 for material, using the orthogonal experiment method, the study of 6-BA KT, 2, 4-D3 kind of nutrients to the influence of wheat injury. result The result shows that the concentration of 2, 4-d on the injury the most inf

4、luence, 6-to minimal impact on the BA, the influence of KT between two composes. By orthogonal analysis results can be concluded that the optimal medium formula: MS + 2, 4-d 0.5 mg/L + KT 1.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L + sugar 3% + 0.8% AGAR.Key words: wheat callus mature embryo orthogonal method to salt

5、mutant前言小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，小麥成熟胚具有取材方便、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn),已成功應(yīng)用于小麥組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究,可望取代幼胚成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方便受體。中國(guó)鹽堿地分布面積廣，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，因此小麥耐鹽突變體的篩選隊(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分重要。近年來，小麥組織培養(yǎng)一直受到廣泛關(guān)注，以小麥幼胚，幼穗，葉片，根等外植體進(jìn)行培養(yǎng)都成功獲得了再生植株。為了提高小麥成熟胚的出愈率和植株再生率，人們做了不少研究，而小麥成熟胚具有良好再生能力，種子保存期長(zhǎng)，易獲得，可用于較長(zhǎng)時(shí)間的研究。所以本次試驗(yàn)以小麥的成熟胚為外植體源，3種激素九種不同激素配比的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)研究。1、 材料與方法1.1

6、 試驗(yàn)材料 植物材料 小麥煤生0308 試驗(yàn)器具超凈工作臺(tái)、鑷子、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、記號(hào)筆、打火機(jī)1.2 試驗(yàn)方法材料的預(yù)處理將小麥種子浸泡在水中1天，試驗(yàn)操作前，將種子放在燒杯中用流水沖洗30min以上。試驗(yàn)操作將盛有泡好的種子的燒杯轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，向燒杯中加入75%乙醇，浸泡40S后，倒出乙醇；再向燒杯加入0.1%的升汞，浸泡8min，倒出升汞，使用無菌水沖洗3到5次，每次5min左右后放入培養(yǎng)皿備用。培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件1.1.2 培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基的激素濃度如表1所示：表1、培養(yǎng)基激素濃度2,4-D(mg/LKT(mg/L6-BA(mg/L9-10009-209-309-409-59

7、-609-709-809-9基本培養(yǎng)基為：MS+蔗糖3%+瓊脂0.8%²高壓濕熱滅菌15min）溫度25 左右的溫室培養(yǎng)，每天光照14h。每周定期觀察成熟胚額培養(yǎng)情況，愈傷組織的誘導(dǎo)情況、生長(zhǎng)情況、是否污染等，并做好統(tǒng)計(jì)。2、 結(jié)果與分析2.1 愈傷組織培養(yǎng)情況培養(yǎng)一周后材料表面出現(xiàn)粘膜，出現(xiàn)了愈傷組織，呈少量白色和綠色的愈傷。第二到四周后，愈傷組織更加明顯，誘導(dǎo)現(xiàn)象更明顯，呈現(xiàn)黑色，青色的愈傷組織，有些出現(xiàn)了染菌的現(xiàn)象，處理完，余下的繼續(xù)觀察培養(yǎng)。表二為接種四周后培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的材料統(tǒng)計(jì)表表2 各培養(yǎng)基的統(tǒng)計(jì)結(jié)果2,4-D（mg/L）KT (mg/L6-BA (mg/L接

8、種數(shù)出芽數(shù)愈傷數(shù)死亡數(shù)愈傷率9-10004814102420.83%9-204617111817.74%9-30624413020.97%9-40848741088.10%9-5321214743.75%9-605714411571.93%9-7045729864.44%9-80320151746.88%9-931125480.65%愈傷率=（愈傷數(shù)/接種數(shù)）×100%實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析表見表3極差記為R。R1R2R3，說明三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)成熟胚培養(yǎng)的影響效果的大小為2,4-D的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響最大，KT次之，6-BA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響是最小的。2,4-D的最優(yōu)濃度為；對(duì)于因素KT的最優(yōu)濃

9、度為；對(duì)于因素6-BA的最優(yōu)濃度為由正交分析得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。表3 直觀分析表所在列1234因素2,4-DKT6-BA試驗(yàn)誤差試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)11111試驗(yàn)21222試驗(yàn)31333試驗(yàn)42123試驗(yàn)52231試驗(yàn)62312試驗(yàn)73132試驗(yàn)83213試驗(yàn)93321均值1均值2均值3極差2.3 由直觀分析表做出的效應(yīng)曲線圖見表4隨著2,4-D濃度的增加，誘導(dǎo)率先上升后下降，說明2,4-D的最適濃度在0.5mg/L附近，在研究范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中KT濃度的升高，誘導(dǎo)率先降低再升高，說明KT的最

10、適濃度在1.0mg/L之后，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率先上升后下降，最高點(diǎn)在0.5mg/L。當(dāng)實(shí)驗(yàn)低于這個(gè)值的時(shí)候，誘導(dǎo)率隨著其濃度增加增加，高于此值時(shí)候，誘導(dǎo)率隨濃度的增加而減少，因此0.5mg/L是最適合的值對(duì)于2,4-D和6-BA。而KT的存在對(duì)培養(yǎng)基影響不大。表4 效應(yīng)曲線圖2.4 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出的方差分析表見表5將偏差平方和記為S。F比（2,4-D）1，F(xiàn)比(KT 1，F(xiàn)比(6-BA 1，F(xiàn)比(試驗(yàn)誤差 1，利用正交小助手的幫助下分析，生長(zhǎng)物質(zhì)的影響對(duì)小麥愈傷組織的誘導(dǎo)率都不是太顯著，只有2,4-D在KTS(6-BA S(試驗(yàn)誤差可知，因素影響的主次順序?yàn)?,4-D0.5mg/L

11、的時(shí)候?qū)π←溄M織的誘導(dǎo)率是最高的。在適當(dāng)?shù)臈l件下，包括預(yù)處理，時(shí)間，溫度對(duì)小麥種子的出愈率都有好的影響。表5 方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性2,4-D2KT26-BA2試驗(yàn)誤差2誤差83、 結(jié)論與討論本次實(shí)驗(yàn)里，利用小麥成熟胚培養(yǎng)技術(shù)獲得其愈傷組織以及實(shí)現(xiàn)耐鹽突變體的篩選，其中本實(shí)驗(yàn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法尋找最合適形成愈傷組織的因素和水平。以媒生0308為材料，討論9種培養(yǎng)基和3種激素配比對(duì)小麥成熟胚離體培養(yǎng)的影響及用紫外燈光線照射所產(chǎn)生的耐鹽突變體的篩選，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列計(jì)算及其分析，得出結(jié)論2,4-D的濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大，及最優(yōu)的培養(yǎng)基配方是MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。參考文獻(xiàn)【1】賀杰;常景玲;小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生體系的研究J;安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年05期 【2】唐宗祥;張懷瓊;張懷渝;晏本菊;任正隆;影響小麥成熟胚形成愈傷組織的因素A;2003年全